Пмл 1220 0 2б: Пускатель ПМЛ-1220 О*2Б 220В РТЛ-1006

Обработка клеток PC-3 50 мкм As ₂ O ₃ -индуцированные морфологические изменения, характерные для апоптоза. Окрашивание hoechst 33342 показало сокращение ядра с конденсацией и фрагментацией хроматина, что свидетельствует о том, что эти клетки были на пути к гибели с апоптотической морфологией (рис.2 А ) ⇓ . Одновременное окрашивание родамином 123 выявило снижение трансмембранного потенциала митохондрий (рис. 2 A ). ⇓ , тогда как необработанные клетки PC-3 имели здоровые ядра и яркое окрашивание родамином 123, что указывает на интактный трансмембранный потенциал митохондрий (рис. 2 A ). ⇓ . Апоптоз был сделан видимым с помощью TUNEL-положительного окрашивания ядер, которое выявляло фрагментацию ядерной ДНК в клетках, обработанных As ₂ O ₃ (рис. 2 B ) ⇓ .В необработанных клетках сигнал отсутствовал. Связь между апоптозом и дозой As ₂ O ₃ была четко показана анализом проточной цитометрии. Дозозависимая индукция апоптоза была обнаружена с помощью проточной ДНК-цитометрии (рис. 3 A ). ⇓ и с помощью проточно-цитометрического анализа TUNEL (рис. 3 B ) ⇓ в клетках ПК-3, обработанных в течение 36 ч As ₂ O ₃ . Зависимая от времени индукция апоптоза была также показана с помощью проточной цитометрии ДНК в клетках PC-3, обработанных 20 мкм As ₂ O ₃ (рис.3 С ) ⇓ . Обработка клеток PC-3 низкими концентрациями (≤4 мкм) As ₂ O ₃ -индуцированная остановка клеточного цикла в фазе G ₂ -M, тогда как меньшее количество клеток подверглось апоптозу при этих концентрациях (рис. D ) ⇓ . Подавление роста видно на рис. 1 A ⇓ следовательно, в основном это связано с задержкой фазы G ₂ -M. Соответствующая IC ₅₀ s клеток PC-3 составляла 2,5 мкм через 48 часов и 2,4 мкм через 96 часов. Зависимая от времени индукция апоптоза не была показана с помощью проточной цитометрии ДНК в клетках PC-3, обработанных 2 мкМ As ₂ O ₃ до 96-часовой инкубации (данные не показаны).Эти результаты показывают, что As ₂ O ₃ при высоких концентрациях индуцирует апоптоз в клетках PC-3, но вызывает только ингибирование роста при низких концентрациях.

In vitro индукция апоптоза в клетках PC-3 с помощью As ₂ O ₃ . В A клетки инкубировали с hoechst 33342 (1 мкг / мл) и потенциально-чувствительным зондом родамином 123 (10 мкг / мл), чтобы сделать видимыми морфологию ядра и потенциал митохондриальной мембраны; a и b , необработанные; c и d , обработанные As ₂ O ₃ (50 мкм, 8 ч).В B , плавающие клетки, окрашенные методом TUNEL, собирали на предметном стекле с использованием цитоспина и помещали в раствор против тушения с DAPI; a и b , необработанные; c и d , обработанные As ₂ O ₃ (20 мкм, 36 ч).

As ₂ O ₃ -индуцированный апоптоз и ингибирование роста в клетках PC-3, показанное анализом проточной цитометрии. A , доза-ответ As ₂ O ₃ -индуцированный апоптоз, обнаруженный с помощью анализа проточной цитометрии ДНК.Фракции Sub-G ₁ увеличились с увеличением As ₂ O ₃ . B , доза-ответ As ₂ O ₃ -индуцированный апоптоз, обнаруженный с помощью анализа проточной цитометрии в анализе TUNEL. C , количественное определение кинетики As ₂ O ₃ -индуцированного апоптоза с помощью анализа проточной цитометрии ДНК. Sub-G ₁ фракции увеличивались со временем во время обработки 20 мкм As ₂ O ₃ . D , As ₂ O ₃ -индуцированное ингибирование роста, показанное анализом проточной цитометрии ДНК.Клетки PC-3 обрабатывали As ₂ O ₃ при низких концентрациях в течение 24 часов. Фракции G ₂ -M увеличивались с увеличением дозы As ₂ O ₃ , но увеличение прерывалось при 8 мкм As ₂ O ₃ .

As

Вестерн-блотов экстрактов клеток PC-3, обработанных As ₂ O ₃ , проводили с антителами, которые распознают активированные фосфорилированные формы, для определения участия MAPK в индуцированной As ₂ O ₃ гибели клеток.Блоты показали зависящую от дозы и времени активацию p38 и JNK1 / 2, но ERK1 / 2 не активировался (фиг.4, A и B ). ⇓ . Активация p38 и JNK1 / 2 также наблюдалась в клеточной линии DU-145 (данные не показаны). Были исследованы другие молекулы в путях передачи сигнала p38 и JNK. Из факторов транскрипции, регулируемых этими двумя киназами, были активированы ATF2 и c-Jun (рис. 4 C ). ⇓ . Из MKK, регулирующих p38 и JNK, MEKK3 / 6 был заметно активирован (рис.4 D ) ⇓ , но активации SEK1 не было (рис. 4 D ) ⇓ . ASK1, член семейства киназ MKK, регулирующий как MEKK3 / 6, так и SEK1 (23) , не был обнаружен в Вестерн-блоттинге клеток PC-3 (данные не показаны). p38, JNK1 / 2 и их нижестоящие молекулы, следовательно, были активированы, тогда как из вышестоящих регуляторов можно было идентифицировать активацию только MEKK3 / 6. Таким образом, было исследовано участие тела PML в индуцированном As ₂ O ₃ апоптозе клеток PC-3.Иммуноцитохимия четко показала, что As ₂ O ₃ индуцировал увеличение экспрессии белка PML в теле PML (рис. 4 E ). ⇓ , но не было совместной локализации телец PML с ASK1 или фосфорилированным-SEK1 (данные не показаны).

Активация p38 и JNK и белка PML в ядерных тельцах PML в клетках PC-3, обработанных As ₂ O ₃ . В A клеточные экстракты клеток PC-3, полученные после 12 часов обработки при указанных концентрациях As ₂ O ₃ , исследовали на три основных киназы MAP с помощью вестерн-блоттинга. поз. ., Контроль положительный. Обработка 0,7 м NaCl клеток HeLa для p38 и JNK. Очищенный белок ERK (New England Biolabs, Inc.). В B клеточные экстракты клеток PC-3, обработанные 50 мкм As ₂ O ₃ в указанное время, исследовали вестерн-блоттингом с использованием p38 и JNK1 / 2. В C клеточные экстракты клеток PC-3, полученные через 3 часа (фосфо ATF2 и ATF2) и 12 часов (фосфо c-Jun и c-Jun) обработки при указанных концентрациях As ₂ O ₃ , были исследовали Вестерн-блоттингом.В D клеточные экстракты клеток PC-3, полученные после 12-часовой обработки при указанных концентрациях As ₂ O ₃ , исследовали в фосфорилированных MEK3 / 6, MEK3, фосфорилированных SEK1 и SEK1 с помощью вестерн-блоттинга. В E , после инкубации с 50 мкМ As ₂ O ₃ в течение 4 ч, иммуноцитохимию для PML проводили, как описано в «Материалы и методы» a – c , без обработки; d – f , As ₂ O ₃ . Обработанные.

Участие p38 и JNK в As

Чтобы определить влияние p38 на передачу внутриклеточного сигнала, SB203580, селективный ингибитор киназы p38, был добавлен к клеткам PC-3, обработанным As ₂ O ₃ . Это добавление подавляло вызванную As ₂ O ₃ активацию ATF2 дозозависимо (рис. 5 A ). ⇓ . Обнаружено небольшое усиление активации p38 (рис.5 B ) ⇓ , тогда как наблюдалось заметное усиление активации JNK1 / 2 и его нижележащего c-Jun (рис. 5 B ). ⇓ . Затем анализ проточной цитометрии ДНК использовали для оценки того, участвует ли киназа р38 в индуцированном As ₂ O ₃ апоптозе. Некоторые клетки PC-3, обработанные одним SB203580, претерпели апоптоз (фиг. 5 C ). ⇓ , тогда как добавление SB203580 к клеткам PC-3, обработанным As ₂ O ₃ , приводило к увеличению апоптотической фракции, которое не было статистически значимым (рис.5 С ) ⇓ . Добавление SB203580 к клеткам DU-145, обработанным As ₂ O ₃ , не уменьшало апоптотическую фракцию (данные не показаны). Эти данные показывают, что ингибирование киназы p38 усиливает активацию сигнального каскада JNK-c-Jun, что предполагает, что p38 может функционировать как медиатор сигнала выживания для защиты от гибели клеток, индуцированной As ₂ O ₃ .

Отсутствие ингибирования ингибитором p38 SB203580 As ₂ O ₃ -индуцированной гибели клеток в клетках PC-3.В A клетки обрабатывали As ₂ O ₃ и SB203580 в указанных концентрациях с предварительной обработкой SB203580 или без нее. Вестерн-блоттинг использовали для исследования активации ATF-2 в клеточных экстрактах. В B клетки обрабатывали 50 мкм As ₂ O ₃ , 20 мкм SB203580 или обоими способами с предварительной обработкой SB203580 или без нее. Вестерн-блоттинг использовали для исследования активации p38, JNK и c-Jun в клеточных экстрактах.В C клетки обрабатывали As ₂ O ₃ и SB203580 в указанных концентрациях с предварительной обработкой SB203580 или без нее. Фракция апоптоза, , то есть , фракция sub-G ₁ , была получена с помощью проточной цитометрии ДНК. Результаты представлены как средние значения ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов. Планки погрешностей , SD.

Чтобы прояснить участие каскада SEK1-JNK в индуцированной As ₂ O ₃ гибели клеток, доминантно-отрицательные SAPK / JNK и SEK1, меченные GFP, были введены в клетки PC-3, и клетки проанализированы с помощью потока цитометрия.После трансфекции и добавления As ₂ O ₃ анализ проточной цитометрии с использованием 7-AAD и EGFP показал, что индуцированная As ₂ O ₃ гибель клеток не ингибировалась сверхэкспрессией pGFP-DN. SAPK / JNK1 и pGFP-DN-SEK1 (данные не представлены) свидетельствуют о том, что ингибирование каскада SEK1-JNK не защищает от гибели клеток, индуцированной As ₂ O ₃ . Этот результат предполагает вклад путей, отличных от SEK1-JNK, в индуцированную As ₂ O ₃ гибель клеток.

Участие каспазы в As

Исследовали роль каспазы в апоптозе клеток, индуцированном As ₂ O ₃ . В анализе активности расщепления, подобной каспазе-3, комбинированное лечение циклогексимидом и антителом против APO-1 / Fas вызывало заметную активацию, которая устранялась специфическим ингибитором каспазо-3-подобной протеазы, z-DEVD-fmk (рис. 6 А ) ⇓ . Напротив, обработка As ₂ O ₃ вызывала лишь небольшое увеличение активности расщепления, подобной каспазе-3 (рис.6 А ) ⇓ . Добавление z-DEVD-fmk возвращало активность на базальный уровень, но небольшое количество клеток PC-3 было спасено этим добавлением от апоптоза, индуцированного As ₂ O ₃ (рис. 6 B ). ⇓ . Эти находки предполагают, что в клетках PC-3 протеазы, подобные каспазе-3, не играют основных ролей в сигнальном пути гибели клеток, индуцированной As ₂ O ₃ . Затем исследовали перекрестные помехи сигналов между каспазой и SAPK. Комбинированная обработка клеток PC-3 As ₂ O ₃ и SB203580 имела ограниченный эффект на активность расщепления, подобную каспазе-3 (рис.6 А ) ⇓ . Аналогично, в Вестерн-блоттинге добавление z-DEVD-fmk не приводило к заметным изменениям уровней фосфорилирования p38 и JNK1 / 2 (данные не показаны). Следовательно, перекрестных помех между каспазой и этими двумя SAPK не было обнаружено.

Анализ активности расщепления, подобной каспазе-3, и влияние ингибирования каспазы-3 на гибель клеток PC-3, обработанных As ₂ O ₃ и различными ингибиторами. В A активность расщепления, подобного каспазе-3, определенная с помощью расщепления DEVD-AFC, была измерена в клетках, обработанных в течение 8 часов различными концентрациями As ₂ O ₃ , ингибиторов или обоих. Планки погрешностей , SD. Планки погрешностей <0,1 были опущены. В B клетки, обработанные As ₂ O ₃ и z-DEVD-fmk, исследовали с помощью проточной цитометрии ДНК, как описано на фиг. 5 C ⇓ . Результаты представлены как средние значения ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов.

Связь между ROS и As

Чувствительный к АФК флуорогенный краситель CM-H ₂ DCFDA был использован в проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии для исследования связи между АФК и As ₂ O ₃ -индуцированный апоптоз в клетках PC-3, обработанных As ₂ О ₃ .Образование АФК было четко показано флуоресцентной микроскопией (рис. 7 A ). ⇓ и проточно-цитометрический анализ (рис.7 A ) ⇓ . Это поколение ROS было полностью подавлено добавлением антиоксиданта NAC (рис. 7 A ). ⇓ . Кроме того, NAC в значительной степени защищал клетки PC-3 от ингибирования роста, индуцированного As ₂ O ₃ . Добавление 10 мм NAC увеличило IC ₅₀ из As ₂ O ₃ с 2,1 до 6,1 мкм. Точно так же NAC резко ингибировал апоптоз, индуцированный As ₂ O ₃ , в проточном цитометрическом анализе TUNEL (рис.7 B ) ⇓ и проточная цитометрия ДНК (рис.7 C ) ⇓ . Аналогичным образом, образование ROS и ингибирование индуцированного As ₂ O ₃ апоптоза NAC также наблюдали в клетках DU-145 (данные не показаны). Кроме того, это добавление ослабляло индуцированную As ₂ O ₃ активацию каспазо-3-подобной активности расщепления (фиг. 6 A ). ⇓ , из p38 (рис.7 C ) ⇓ и JNK (рис.7 C ) ⇓ , доказательство того, что подавление ROS ингибирует апоптоз, индуцированный As ₂ O ₃ , и что ROS регулирует внутриклеточную сигнальную трансдукцию каспаз и SAPK.

Ингибирование As ₂ O ₃ -индуцированная генерация ROS, апоптоз и передача сигнала NAC в клетках PC-3. A , обнаружение ROS с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии. После обработки указанными концентрациями As ₂ O ₃ и NAC клетки инкубировали в бессывороточной среде, содержащей 10 мкМ CM-H ₂ DCFDA, после чего их наблюдали под флуоресцентным микроскопом. Флуоресценцию контролировали проточной цитометрией.В B клетки обрабатывали в течение 36 часов As ₂ O ₃ и NAC в указанных концентрациях, после чего проводили анализ TUNEL. Положительные клетки были обнаружены с помощью проточной цитометрии, как описано в разделе «Материалы и методы». В C клетки, обработанные As ₂ O ₃ и NAC, исследовали с помощью проточной цитометрии ДНК. Результаты представлены как средние значения ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов. Планки погрешностей , SD. D , клеточные экстракты клеток PC-3, полученные после 12 ч обработки при указанных концентрациях As ₂ O ₃ и NAC; Вестерн-блоттинг был использован для изучения активации p38 и JNK.

Наконец, in vivo терапевтическая эффективность As ₂ O ₃ была оценена на модели ортотопических метастазов у ​​мышей. Через пять недель после инокуляции клеток PC-3 в простату мыши ортотопическая опухоль и метастазы в лимфатические узлы были идентифицированы макроскопически и подтверждены гистохимическим анализом с окрашиванием H&E.Ни макроскопических, ни микроскопических метастазов в печени, легких или почках не обнаружено (данные не показаны). Как показано на Рис.8 A ⇓ рост ортотопической опухоли и метастазирование в лимфатические узлы заметно подавлялись обработкой As ₂ O ₃ . Дозозависимое ингибирование ортотопического роста опухоли было статистически значимым (рис. 8 B ). ⇓ . Метастазы в лимфатические узлы также имели тенденцию к дозозависимому ингибированию, но статистическая разница была незначительной ( P = 0.06; Рис.8 C ⇓ ). В течение периода лечения не наблюдалось ни явной тяжелой токсичности, ни потери массы тела. Не было обнаружено значительных различий между группами по количеству эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов в периферической крови (данные не показаны). Гистологическое исследование показало, что серьезных повреждений печени, легких или почек не было (данные не показаны). Окрашивание H&E не позволило выявить терапевтический эффект между группами (рис. 8 D ). ⇓ , но in situ TUNEL анализ опухолевой ткани показал заметное различие между контрольной и обработанной As ₂ O ₃ группами.Больше положительных клеток для анализа in situ TUNEL было идентифицировано в ортотопических опухолях мышей, получавших As ₂ O ₃ , чем у контрольных мышей (фиг. 8 D ). ⇓ . Эти данные показывают, что As ₂ O ₃ индуцирует ингибирование роста опухоли in vitro, и in vivo, на модели ортотопических метастазов у ​​мышей без серьезных признаков токсичности.

In vivo Ингибирование роста опухоли с помощью As ₂ O ₃ в ортотопической мышиной модели клеток PC-3. A , типичные случаи через 5 недель после ортотопической инокуляции клеток PC-3. Семенные пузырьки ( SV ) и мочевой пузырь ( B ) экспонировались у контрольной мыши ( левая панель, ) и мыши, получавшей 5 мг / кг As ₂ O ₃ ( правая панель ) . Подавление роста очевидно как для ортотопической опухоли ( черные стрелки, ), так и для метастазов в забрюшинные лимфатические узлы ( белые стрелки, ) у мышей, получавших 5 мг / кг As ₂ O ₃ . B , доза-ответ As ₂ O ₃ -индуцированное ингибирование роста ортотопической массы опухоли у мышей, получавших As ₂ O ₃ . Разница между контрольной группой и группами, получавшими 5 мг / кг As ₂ O ₃ , была значительной. C , доза-ответ As ₂ O ₃ -индуцированное ингибирование роста числа метастазов в забрюшинных лимфатических узлах. Забрюшинные лимфатические узлы диаметром более 0,5 мм были подсчитаны под микроскопом, и патология была подтверждена.Разница между контролем и группой, получавшей 5 мг / кг As ₂ O ₃ , была незначительной и несущественной ( P = 0,06). D , репрезентативная гистология ортотопической опухоли, образованной клетками PC-3, после лечения. Окрашивание H&E ( a, b ) и анализ in situ TUNEL ( c, d ) проводили в контроле ( a, c ) и 5 ​​мг / кг As ₂ O ₃ -обработанных ( b, d ) мышей.

ОБСУЖДЕНИЕ

Первой целью нашего исследования было показать возможность лечения As ₂ O ₃ при распространенном раке простаты для будущих клинических испытаний.В тестах in vitro обработка As ₂ O ₃ в высоких концентрациях индуцировала апоптоз, но при низких концентрациях только подавляла рост (рис. ⇓ и 3 ⇓ ). В исследовании in vivo , проведенном с нашей моделью ортотопических метастазов на мышах, As ₂ O ₃ индуцировал заметное ингибирование роста опухоли в ортотопических опухолях и маргинальное ингибирование метастазов в забрюшинных лимфатических узлах (рис. 8) ⇓ . Результаты этого исследования in vivo показали, что значительной токсичности для основных органов не было.Наши результаты показывают, что лечение As ₂ O ₃ может оказаться новым, многообещающим подходом к благоприятному лечению андроген-независимого рака простаты. Другой целью было выяснить внутриклеточную передачу сигналов при апоптозе, индуцированном As ₂ O ₃ . Анализ показал, что подавление ROS ингибировало апоптоз, индуцированный As ₂ O ₃ , тогда как SAPK и каспаза этого не делали. Это предполагает, что лекарственные средства, которые продуцируют внутриклеточные АФК, могут быть мощными усилителями апоптоза, индуцированного As ₂ O ₃ .

С момента открытия драматических эффектов, которые As ₂ O ₃ оказывает на APL, в нескольких исследованиях изучалось использование As ₂ O ₃ при лечении солидных видов рака, включая нейробластому, рак желудка и рак головы и шеи (11 , 14 , 24, 25, 26) . Кроме одного (26) , все исследования были in vitro и исследования показали противоопухолевые эффекты, несравнимые с таковыми APL. Как сообщалось, ₂ O ₃ индуцирует апоптоз или ингибирование роста в каждой клеточной линии, но концентрации, использованные в этих исследованиях, были выше, чем используемые в исследованиях, проведенных на гематологических раках.При клинически доступных концентрациях As ₂ O ₃ (<2 мкм) ни в одном из исследований не удалось вызвать полную гибель клеток. Аналогичным образом, в нашем исследовании клеточных линий рака простаты As ₂ O ₃ индуцировал апоптоз со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий при высоких концентрациях, но только ингибированием роста при низких. Эти факты предполагают, что для усиления цитотоксичности As ₂ O ₃ при низких концентрациях необходимо разработать усилитель токсичности As ₂ O ₃ .

Таким образом, мы исследовали внутриклеточный сигнальный механизм апоптоза, индуцированного As ₂ O ₃ . Три основных пути были предложены в качестве критического механизма для апоптоза, индуцированного As ₂ O ₃ : SAPK, каспаза и ROS, но какой механизм на самом деле является критическим для апоптоза, индуцированного As ₂ O ₃ , особенно при солидном раке, еще предстоит определить. В нашем исследовании клеток PC-3 рака простаты ROS оказались наиболее важным из трех сигнальных путей.Аналогичные результаты были получены в другом исследовании, проведенном с клетками CHO от рака яичников. (15) . Он также показал связь АФК с каспазозависимым апоптозом. (15) . Предыдущий анализ клеток NB4 показал, что As ₂ O ₃ -индуцированный апоптоз происходит через киназный путь ASK1-SEK1-JNK, регулируемый генерацией ROS (рукопись готовится 4 и Ref. 19 ). Эти отчеты предполагают, что эти три пути связаны, а не независимы. Анализ взаимосвязи трех путей в андроген-независимых клеточных линиях рака простаты и взаимосвязи трех путей показал, что АФК является регулятором каспаз и SAPK, но никакой связи между каспазами и SAPK обнаружено не было.

Участвует ли активация SAPK в апоптозе, как правило, зависит от типа клеток и стимулов. (27) . В нашем исследовании p38, как и JNK, был активирован в апоптозе, индуцированном As ₂ O ₃ , но ингибирование p38 не защищало андрогеннезависимые клеточные линии рака простаты от индуцированного As ₂ O ₃ апоптоз, а точнее, он активировал путь JNK-c-Jun. Это указывает на то, что в андроген-независимых клеточных линиях рака простаты p38 не участвует в апоптозе, индуцированном As ₂ O ₃ , и что существует некоторая перекрестная передача сигналов между p38 и JNK.Мы здесь предположили, что активация JNK является критической для индуцированного As ₂ O ₃ апоптоза клеток PC-3, но его роль не может быть четко определена из сверхэкспрессии его доминантно-отрицательных форм. В отличие от клеток NB4, 4 в клетках PC-3 не было обнаружено ни активации ASK1, SEK1, ни их совместной локализации с PML (данные не показаны). Эти различия между клетками NB4 и PC-3 могут усложнять интерпретацию роли JNK. В других исследованиях сообщалось, что JNK играет решающую роль в индуцированном As ₂ O ₃ апоптозе как первичного кортикального нейрона крысы, так и линии эпидермальных клеток мыши JB6 Cl41. (11 , 12) .В настоящее время селективные ингибиторы JNK коммерчески недоступны. Требуется дальнейшее исследование JNK-специфических ингибиторов, чтобы выяснить, что это за участие.

Как указано, наш анализ in vitro показал, что низкие концентрации As ₂ O ₃ могут вызывать только ингибирование роста, но не апоптоз. Чтобы воспроизвести это ингибирование роста in vitro в экспериментах in vivo , мы вводили As ₂ O ₃ мыши SCID, простата которой была инокулирована клетками PC-3.В уникальном исследовании in vivo терапевтический эффект As ₂ O ₃ на солидный рак, As ₂ O ₃ был очень эффективным как для самой опухоли, так и для сосудов, питающих опухоль. (26) . Хотя эти результаты могут быть очень важны экспериментально, необходимо преодолеть два важных момента, чтобы получить клиническую значимость. Во-первых, высокая доза (10 мг / кг), используемая для однократной инъекции As ₂ O ₃ (26) был летальным у двух из трех мышей SCID, использованных в нашем исследовании (данные не показаны).Следовательно, многократное введение в этой дозировке должно быть летальным для всех мышей SCID. В клинических условиях требуются менее токсичные агенты и менее инвазивные протоколы введения, особенно для пожилых пациентов с раком простаты. В нашем исследовании на мышах суточная доза As ₂ O ₃ была снижена наполовину, до 5 мг / кг, и было показано, что непрерывное введение безопасно в течение 5-недельного периода без значительной токсичности для периферических органов. клетки крови, печень, почки или легкие.Другой момент — терапевтические эффекты As ₂ O ₃ на метастазы. Наша ортотопическая модель преодолевает этот момент, устанавливая значительные метастазы в забрюшинных лимфатических узлах и позволяя одновременно оценивать терапевтические эффекты соединения на первичные и метастатические поражения. Хотя необходимы дополнительные исследования для определения корреляции с учетом дозы As ₂ O ₃ и концентраций As ₂ O ₃ в сыворотке и тканях, мы считаем, что наше исследование является более клинически значимым и показывает выполнимость клиническое применение As ₂ O ₃ для лечения андрогеннезависимого рака простаты.

Нам удалось воспроизвести ингибирование роста in vitro и на модели ортотопических метастазов in vivo , но монотерапия As ₂ O ₃ не вызвала полного исчезновения опухоли. Мы думаем, что это ингибирование роста опухоли in vivo указывает на предел монотерапии As ₂ O ₃ , поскольку он не может вызвать полную гибель клеток из-за его низких внутриклеточных концентраций. Чтобы добиться исчезновения опухоли in vivo и без увеличения дозы As ₂ O ₃ , необходимо разработать усилители индуцированного As ₂ O ₃ апоптоза.Наше исследование показало, что генерация АФК играет центральную роль в индуцированном As ₂ O ₃ апоптозе. Следовательно, лекарственные средства, которые продуцируют внутриклеточные АФК или мешают поглотителям АФК, являются потенциальными кандидатами на усиление индуцированного As ₂ O ₃ апоптоза. Фактически, l-бутионин сульфоксимин, внутриклеточный агент, истощающий глутатион, продуцирует большое количество АФК и, как было показано, значительно усиливает индуцированный As ₂ O ₃ апоптоз в других линиях солидных раковых клеток. (28) .В будущем комбинированная терапия, в которой используется As ₂ O ₃ вместе с этими препаратами, может оказаться полезной для лечения андроген-независимого рака простаты.

Благодарности

Мы благодарим Акико Х. Попель, Мегуми Сугимото и Харуми Йошии за секретарскую помощь в подготовке рукописи. Мы благодарим профессора Тадао Серикава, Осаму Фуджи и других сотрудников Института лабораторных животных Киотского университета, Высшей школы медицины за бережное отношение к животным; Профессор Э.Нисиде (Высшая школа биологических исследований Университета Киото) за любезное предоставление pcDL-SR-DNSAPK / JNK и доктору Хадзиме Накамуре (Институт вирусных исследований, Университет Киото) за полезное обсуждение; Ая Ямагути, Ли Куин, Тизуко Сайо, Томоко Мацусита и Ицуко Фудзивара за их техническую помощь.

Сноски

• Расходы на публикацию этой статьи были частично покрыты за счет оплаты страницы. Поэтому данная статья должна быть помечена как реклама в соответствии с 18 U.S.C. Раздел 1734 исключительно для того, чтобы указать на этот факт.

• №1 Частично поддержано грантами 10154203 (Ю.К.), 12215156 (А.К.) Министерства образования, науки, культуры и спорта Японии; 11-10 (Ю.К.) от Министерства здравоохранения и социального обеспечения Японии; грант Фонда наук о жизни Санкё (Ю.К.) и грант Японского общества содействия развитию науки для молодых ученых (Х.М.).

• ↵2 Кому следует обращаться с просьбами о перепечатке, на кафедре функциональной биологии Высшей школы биологических исследований Киотского университета, Йошида-Коноэ-тё, Сакё-ку, Киото 606-8501, Япония.Телефон: 81-75-753-7675. Факс: 81-75-753-7676; Эл. Почта: kakizuka {at} lif.kyoto-u.ac.jp

• ↵3 Используемые сокращения: ATRA, all- trans- retinoic acid; APL, острый промиелоцитарный лейкоз; MAPK, митоген-активированная протеинкиназа; АФК, активные формы кислорода; JNK, c-jun NH ₂ -концевая протеинкиназа; ERK, киназа, регулируемая внеклеточными сигналами; SAPK, стресс-активируемые протеинкиназы; ASK1, киназа, регулирующая сигнал апоптоза; SEK1, киназа SAPK-ERK; ПМЛ, промиелоцитарный лейкоз; z-DEVD-fmk, карбобензоксил-Asp-Glu-Val-Asp-фторметан; NAC, N -ацетил-1-цистеин; WST-8, мононатриевая соль 2- (2-метокси-4-нитрофенил) -3- (4-нитрофенил) -5- (2,4-дисульфофенил) -2H-тетразолия; TUNEL, мечение на конце нуклеотида, опосредованное дезоксинуклеотидилтрансферазой; DAPI, 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол; MKK, MAPK киназа; EGFP, улучшенный GFP; 7-AAD, 7-аминоактиномицин D; Ac-DEVD-AFC, ацетил-Asp-Glu-Val-Asp-амино-7-амино-4-трифторметил кумарин; CM-H ₂ DCFDA, 5- (и-6) -хлорметил-2 ‘, 7’-дихлородигидрофлуоресцеиндиацетат; ТКИД, тяжелый комбинированный иммунодефицит; GFP, зеленый флуоресцентный белок.

• №4 С. Ясуда, С. Хори, Х. М. и А. Какидзука, рукопись в стадии подготовки.

• Получено 20 декабря 2000 г.
• Принято 18 мая 2001 г.

• © 2001 Американская ассоциация исследований рака.

Каталожные номера

1. ↵

   Oh W. K., Kantoff P. W. Управление гормонорезистентным раком простаты: современные стандарты и перспективы на будущее.J. Urol., 160 : 1220-1229, г. 1998.

2. ↵

   Сегава Т., Такебаяси Х., Какехи Ю., Йошида О., Нарумия С., Какидзука А. Простат-специфическая амплификация расширенной экспрессии полиглутамина: новый подход к генной терапии рака. Cancer Res., 58 : 2282-2287, г. 1998.

3. ↵

   Хоффман Р. М. Ортотопические метастатические мышиные модели для открытия и оценки противоопухолевых препаратов: мост в клинику.Расследование. Новые препараты., 17 : 343-359, г. 1999.

4. ↵

   Стивенсон Р. А., Динни К. П., Годжи К., Ордонез Н. Г., Киллион Дж. Дж., Фидлер И. Дж. Метастатическая модель рака простаты человека с использованием ортотопической имплантации голым мышам. J. Natl. Cancer Inst. (Bethesda), 84 : 951-957, г. 1992.

5. ↵

   Ян М., Цзян П., Сун Ф. X., Хасегава С., Баранов Э., Чишима Т., Шимада Х., Мосса А. Р., Хоффман Р. М. Флуоресцентная ортотопическая модель метастазов в кости рака простаты человека. Cancer Res., 59 : 781-786, 1999.

6. ↵

   Maeda H., Segawa T., Kamoto T., Yoshida H., Kakizuka A., Ogawa O., Kakehi Y. Быстрое обнаружение потенциальных метастатических очагов в модели ортотопической инокуляции андроген-чувствительных клеток рака простаты, введенных зеленым флуоресцентный белок. Простата, 45 : 335-340, 2000 г.

7. ↵

   Huang M. E., Ye Y. C., Chen S. R., Chai J. R., Lu J. X., Zhoa L., Gu L. J., Wang Z. Y. Использование ретиноевой кислоты all- trans в лечении острого промиелоцитарного лейкоза. Кровь, 72 : 567-572, 1988.

8. ↵

   Kakizuka A., Miller WH, Jr., Umesono K., Warrell RP, Jr., Frankel SR, Murty VV, Дмитровский E., Evans RM Хромосомная транслокация t (15; 17) при остром промиелоцитарном лейкозе человека сливает RARα с новый предполагаемый фактор транскрипции, PML.Клетка, 66 : 663-674, г. 1991.

9. ↵

   Шен ZX, Chen GQ, Ni JH, Li XS, Xiong SM, Qiu QY, Zhu J., Tang W., Sun GL, Yang KQ, Chen Y., Zhou L., Fang ZW, Wang YT, Ma J ., Чжан П., Чжан Т.Д., Чен С.Дж., Чен З., Ван З.Й. Использование триоксида мышьяка (As ₂ O ₃ ) в лечении острого промиелоцитарного лейкоза (APL): II. Клиническая эффективность и фармакокинетика у пациентов с рецидивом.Кровь, 89 : 3354-3360, г. 1997.

10. ↵

    Chen GQ, Shi XG, Tang W., Xiong SM, Zhu J., Cai X., Han ZG, Ni JH, Shi GY, Jia PM, Liu MM, He KL, Niu C., Ma J., Zhang П., Чжан Т.Д., Пол П., Наое Т., Китамура К., Миллер В., Ваксман С., Ван З.Й., де Х., Чен С.Дж., Чен З. Использование триоксида мышьяка (As ₂ O ₃ ) при лечении острого промиелоцитарного лейкоза (APL): I. As ₂ O ₃ оказывает зависимое от дозы двойное действие на клетки APL.Кровь, 89 : 3345-3353, г. 1997.

11. ↵

    Huang C., Ma W. Y., Li J., Dong Z. Мышьяк индуцирует апоптоз через c-Jun NH ₂ -концевой киназозависимый, p53-независимый путь. Cancer Res., 59 : 3053-3058, г. 1999.

12. ↵

    Namgung U., Xia Z. Арсенит-индуцированный апоптоз в корковых нейронах опосредуется N-концевой протеинкиназой 3 c-Jun и протеинкиназой, активируемой митогеном p38.J. Neurosci., 20 : 6442-6451, г. 2000.

13. ↵

    Самет Дж. М., Грейвс Л. М., Куэй Дж., Дейли Л. А., Девлин Р. Б., Гио А. Дж., Ву В., Бромберг П. А., Рид В. Активация MAPK в эпителиальных клетках бронхов человека, подвергшихся воздействию металлов. Являюсь. J. Physiol, 275 : L551-L558, 1998.

14. ↵

    Akao Y., Nakagawa Y., Akiyama K. Триоксид мышьяка индуцирует апоптоз в клеточных линиях нейробластомы посредством активации каспазы 3 in vitro .FEBS Lett., 455 : 59-62, 1999.

15. ↵

    Чен Ю. К., Лин-Шиау С. Ю., Лин Дж. К. Участие активных форм кислорода и активация каспазы 3 в апоптозе, индуцированном арсенитом. J. Cell Physiol., 177 : 324-333, г. 1998.

16. ↵

    Блайески А. Л., Кауфманн С. Х. Методы обнаружения протеолиза во время апоптоза в интактных клетках Studzinski G. P. eds. . Апоптоз, : 215-238, Oxford University Press, Нью-Йорк 1999 г.

17. ↵

    Холливелл Б., Гаттеридж Дж. М. Роль свободных радикалов и каталитических ионов металлов в заболеваниях человека: обзор. Методы Enzymol., 186 : 1-85, 1990.

18. ↵

    Dai J., Weinberg R. S., Waxman S., Jing Y. Злокачественные клетки могут быть сенсибилизированы триоксидом мышьяка, чтобы подвергнуться ингибированию роста и апоптозу, посредством модуляции окислительно-восстановительной системы глутатиона. Кровь, 93 : 268-277, 1999 г.

19. ↵

    Jing Y., Dai J., Chalmers-Redman R.M., Tatton W.G., Waxman S. Триоксид мышьяка селективно индуцирует апоптоз клеток острого промиелоцитарного лейкоза через зависимый от перекиси водорода путь. Кровь, 94 : 2102-2111, г. 1999.

20. ↵

    Hatai T., Matsuzawa A., Inoshita S., Mochida Y., Kuroda T., Sakamaki K., Kuida K., Yonehara S., Ichijo H., Takeda K. Выполнение киназы 1, регулирующей сигнал апоптоза ( ASK1) -индуцированный апоптоз за счет митохондриально-зависимой активации каспаз.J. Biol. Chem., 275 : 26576-26581, 2000.

21. ↵

    Ясуда С., Иноуэ К., Хирабаяси М., Хигасияма Х., Ямамото Ю., Фуюхиро Х., Комуре О., Танака Ф., Собуэ Г., Цучия К., Хамада К., Сасаки Х., Takeda K., Ichijo H., Kakizuka A. Запуск гибели нейрональных клеток путем накопления активированного SEK1 на ядерных полиглутаминовых агрегациях в тельцах PML. Гены Клетки, 4 : 743-756, г. 1999.

22. ↵

    Ван Т.H., Popp DM, Wang HS, Saitoh M., Mural JG, Henley DC, Ichijo H., Wimalasena J. Дисфункция микротрубочек, индуцированная паклитакселом, инициирует апоптоз через как c-Jun N-концевую киназу (JNK) -зависимую, так и независимую пути в раковых клетках яичников. J. Biol. Chem., 274 : 8208-8216, г. 1999.

23. ↵

    Итидзё Х., Нисида Э., Ирие К., тен Дийке П., Сайто М., Моригути Т., Такаги М., Мацумото К., Миядзоно К., Гото Ю.Индукция апоптоза с помощью ASK1, MAPKKK млекопитающих, который активирует сигнальные пути SAPK / JNK и p38. Наука (Вашингтон, округ Колумбия), 275 : 90-94, 1997.

24. ↵

    Zhang T. C., Cao E. H., Li J. F., Ma W., Qin J. F. Индукция апоптоза и ингибирование роста клеток MGC-803 рака желудка человека с помощью триоксида мышьяка. Евро. J. Рак, 35 : 1258-1263, г. 1999.

25. ↵

    Сеол Дж.Г., Пак В. Х., Ким Э. С., Юнг С. В., Хюн Дж. М., Ким Б. К., Ли Ю. Ю. Влияние триоксида мышьяка на остановку клеточного цикла в клеточной линии PCI-1 рака головы и шеи. Biochem. Биофиз. Res. Commun., 265 : 400-404, г. 1999.

26. ↵

    Лью Ю. С., Браун С. Л., Гриффин Р. Дж., Сонг К. В., Ким Дж. Х. Триоксид мышьяка вызывает селективный некроз в солидных опухолях мышей за счет остановки сосудов. Cancer Res., 59 : 6033-6037, г. 1999 г.

27. ↵

    Леппа С., Боманн Д. Разнообразные функции передачи сигналов JNK и c-Jun в ответ на стресс и апоптоз. Онкоген, 18 : 6158-6162, г. 1999.

28. ↵

    Yang C.H., Kuo M. L., Chen J. C., Chen Y. C. Чувствительность к триоксиду мышьяка связана с низким уровнем глутатиона в раковых клетках. Br. J. Рак, 81 : 796-799, 1999.

% PDF-1.4 % 1 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 4 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 7 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 10 0 obj> / ProcSet [/ PDF / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 13 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 16 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 19 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 22 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 25 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 28 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 31 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 34 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 37 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 40 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 43 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 46 0 obj> / ProcSet [/ PDF / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 49 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 52 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 55 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 58 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 61 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 64 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 67 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 70 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 73 0 obj> / ProcSet [/ PDF / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 76 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 79 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 82 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 85 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 88 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 91 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 94 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 97 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 100 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 103 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 106 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 109 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 112 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 115 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 118 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 121 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 124 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 127 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 130 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 133 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 136 0 obj> / ProcSet [/ PDF / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 139 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 142 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 145 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 148 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 151 0 obj> / ProcSet [/ PDF / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 154 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 157 0 obj> / ProcSet [/ PDF / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 160 0 obj> / ProcSet [/ PDF / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 163 0 obj> / ProcSet [/ PDF / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 166 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 169 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 172 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 175 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 178 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 181 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 184 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 187 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 190 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 193 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 196 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 199 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 202 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 205 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 208 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 211 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 214 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 217 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 220 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 223 0 obj> / ProcSet [/ PDF / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 226 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 229 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 232 0 obj> / ProcSet [/ PDF / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 235 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 238 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 241 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 244 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 247 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 250 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 253 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 256 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 259 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 262 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 265 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 268 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 271 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 274 0 объект> эндобдж 275 0 объект> эндобдж 276 0 объект> эндобдж 277 0 объект> эндобдж 278 0 объект> эндобдж 279 0 объект> эндобдж 280 0 obj> эндобдж 281 0 объект> эндобдж 282 0 объект> эндобдж 283 0 объект> эндобдж 284 0 obj> эндобдж 285 0 объект> эндобдж 286 0 obj> эндобдж 287 0 obj> эндобдж 288 0 obj> эндобдж 289 0 obj> эндобдж 290 0 объект> эндобдж 291 0 объект> эндобдж 292 0 объект> эндобдж 293 0 объект> эндобдж 294 0 объект> эндобдж 295 0 объект> эндобдж 297 0 объект> эндобдж 299 0 obj> эндобдж 300 0 obj> / ProcSet [/ PDF / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 314 0 obj> поток

% PDF-1.4 % 1 0 объект > / F 2 0 R >> эндобдж 2 0 obj > эндобдж 3 0 obj > эндобдж 4 0 obj > эндобдж 5 0 obj > эндобдж 6 0 obj > эндобдж 7 0 объект > эндобдж 8 0 объект > эндобдж 9 0 объект > эндобдж 10 0 obj > эндобдж 11 0 объект > эндобдж 12 0 объект > эндобдж 13 0 объект > эндобдж 14 0 объект > эндобдж 15 0 объект > эндобдж 16 0 объект > эндобдж 17 0 объект > эндобдж 18 0 объект > эндобдж 19 0 объект > эндобдж 20 0 объект > эндобдж 21 0 объект > эндобдж 22 0 объект > эндобдж 23 0 объект > эндобдж 24 0 объект > эндобдж 25 0 объект > эндобдж 26 0 объект > эндобдж 27 0 объект > эндобдж 28 0 объект > эндобдж 29 0 объект > эндобдж 30 0 объект > эндобдж 31 0 объект > эндобдж 32 0 объект > эндобдж 33 0 объект > эндобдж 34 0 объект > эндобдж 35 0 объект > эндобдж 36 0 объект > эндобдж 37 0 объект > эндобдж 38 0 объект > эндобдж 39 0 объект > эндобдж 40 0 объект > эндобдж 41 0 объект > эндобдж 42 0 объект > эндобдж 43 0 объект > эндобдж 44 0 объект > эндобдж 45 0 объект > эндобдж 46 0 объект > эндобдж 47 0 объект > эндобдж 48 0 объект > эндобдж 49 0 объект > эндобдж 50 0 объект > эндобдж 51 0 объект > эндобдж 52 0 объект > эндобдж 53 0 объект > эндобдж 54 0 объект > эндобдж 55 0 объект > эндобдж 56 0 объект > эндобдж 57 0 объект > ручей HW [s ۺ ~ [Ȏ} rn89y% HHb_ ߽