Сайт мультиплекс: Сейчас в кино, Афиша — Кинотеатр Multiplex

Кінотеатр MULTIPLEX у Караван Дніпро — придбати квиток у кінотеатр Караван

З 14 грудня 2017 року у мережі кінотеатрів Multiplex відміняється послуга бронювання квитків. Це пов’язано з тим, що досить часто люди не встигають придбати квитки до зняття броні, або зовсім не приходять до кінотеатру. Тому інші глядачі не можуть обрати найкращі місця.
ПРАВИЛА РОБОТИ МЕРЕЖІ КІНОТЕАТРІВ «МУЛЬТИПЛЕКС»

ЗАГАЛЬНІ ПОЛОЖЕННЯ
Дані правила розроблені у відповідності до Цивільного Кодексу України, Закону України «Про кінематографію» та Закону України «Про захист прав споживачів».
Дані правила обов’язкові для дотримання всіма Відвідувачами мережі кінотеатрів «МУЛЬТИПЛЕКС».

1. ПРАВИЛА ВІДВІДУВАННЯ КІНОТЕАТРУ МЕРЕЖІ «МУЛЬТИПЛЕКС»:
1.1. Фільми, що демонструються в різних форматах, позначаються наступними значками: 2D, 3D, Twins, IMAX, ScreenX тощо.
1.2. Для перегляду фільмів у форматі 3D обов’язково необхідно мати при собі персональні 3D-окуляри. У разі відсутності 3D окулярів Відвідувач може придбати їх в касі кінотеатру або онлайн.

1.3. Продані в касі квитки підлягають поверненню або обміну виключно за наявності чеку на придбання квитків у касі кінотеатру.
1.4. Для оформлення повернення квитків, придбаних онлайн, необхідно заповнити форму на сайті, в розділі «Допомога» → «Купівля та повернення квитків» або в додатку в розділі «Повернення квитків».
1.5. Продані квитки підлягають поверненню тільки в наступних випадках: відміни сеансу (форс-мажор), ненадання інформації про вікові обмеження на перегляд фільму, заміни фільму або неякісної демонстрації з вини кінотеатру. При цьому, якщо Відвідувач прийняв рішення з якоїсь причини повернути квитки, рекомендуємо звернутися в касу не пізніше як за 30 хвилин до початку сеансу, щоб інші Відвідувачі могли скористатися цими місцями й відвідати кіносеанс.
1.6. Обмін квитка на наступний сеанс здійснюється в межах еквівалентної вартості квитка за наявності чеку придбання.
1.7. У разі запізнення Відвідувача на сеанс, неприбуття на кіносеанс чи відмови Відвідувача від перегляду фільму після початку кінофільму, квитки на цей сеанс не підлягають обміну або поверненню до каси.

2. УМОВИ ВІДВІДУВАННЯ КІНОЗАЛІВ:
2.1. Відвідувачі допускаються на територію кінотеатру тільки за наявності придбаного квитка та незчитаного QR-коду (не погашеного). Скануванню підлягають квитки в паперовому (друкованому) або електронному вигляді.
2.2. Відвідувачі повинні зберігати квитки (електронні/паперові) для контролю до кінця сеансу. Кінотеатр не зобов’язаний допускати Відвідувача на сеанс у випадку втрати квитка.
2.3. Відвідувач має можливість придбати квиток протягом 20 хвилин після початку сеансу та пройти до кінозалу протягом 30 хвилин після початку сеансу за наявності придбаного квитка на сеанс та незчитаного QR-коду.
2.4. Відвідувач має право перебувати лише на тому сеансі, на який було придбано квиток.

2.5. Адміністрація кінотеатру має право вимагати у Відвідувача пред’явити квиток під час сеансу для здійснення додаткового контролю.
2.6. У разі виходу Відвідувача із кінозалу під час сеансу, співробітник кінотеатру має право перевірити його квиток при поверненні до кінозалу, у разі відсутності квитка співробітник кінотеатру має право не допускати до кінозалу.
2.7. Квиток вважається недійсним при відсутності QR-коду.
2.8. Займати місця в залі необхідно згідно з нумерацією ряду та місця, зазначених у квитку.
2.9. У залі заборонено пересідати на інші місця під час сеансу.
2.10. У залах кінотеатру категорично забороняється проводити фото та відеозйомку, користуватися будь-якою записуючою апаратурою відповідно до Закону України «Про державну підтримку кінематографії України», Закону України «Про авторське право і суміжні права», Кодексу України про адміністративні правопорушення, Кримінального кодексу України.
2.11. Перебуваючи в кінозалі, рекомендовано переводити мобільний телефон у режим без звуку, щоб не заважати іншим Відвідувачам.
2.12. Категорія осіб, затверджених адміністрацією, має можливість придбати квитки зі знижкою/за зниженою ціною (за наявності відповідних документів).
2.13. Передбачені пільги можуть бути скасовані відповідно до вказівки власника прав (ліцензії) на прокат фільму, про що кінотеатр повідомляє шляхом розміщення оголошення на офіційному сайті компанії.

3. ЗАБОРОНЕНО:
3.1. Перебування на території кінотеатру осіб, що мають ознаки алкогольного та/або наркотичного сп’яніння.
3.2. Проносити до кінотеатру вогнепальну, газову та/або холодну зброю, спеціальні засоби, вибухові пристрої та піротехніку, газові балончики та пневматичну зброю. Виняток становлять працівники правоохоронних органів Збройних Сил України та Національної Гвардії України, які мають табельну зброю та відвідують кінотеатр з метою виконання службових обов’язків.

3.3. Згідно із Законом України «Про заходи щодо попередження та зменшення вживання тютюнових виробів і їх шкідливого впливу на здоров’я населення», забороняється палити. Також забороняється палити електронні цигарки, IQOS, Vape та інше в кінозалі та на території кінотеатру, крім спеціально відведених для паління місць на території торгово-розважального центру (надалі — ТРЦ).
3.4. Смітити й розкидати різні предмети (упаковки, жувальні гумки, серветки тощо).
3.5. Знаходитись на території кінотеатру з тваринами.
3.6. Перебування на території кінотеатру в нічний час (з 22:00 до 6:00), а також на сеансах, що закінчуються після 22:00 до 6:00, осіб, молодших за 16 років, без супроводу батьків, або осіб, що їх замінюють згідно із законодавством.
3.7. Нецензурно лаятися, грати в азартні ігри, агресивно поводитися, порушувати тишу, використовувати предмети, що створюють шумовий ефект та заважають відпочинку інших Відвідувачів кінотеатру. Працівники кінотеатру мають право самостійно або із залученням представників служби охорони вивести правопорушників із кінозалу або кінотеатру, а також викликати поліцію для усунення правопорушення. У такому разі кінотеатр не зобов’язаний компенсувати вартість придбаного Відвідувачем Квитка.
3.8. Створювати перешкоди в роботі співробітникам кінотеатру, входити до службових та технічних приміщень.
3.9. Проносити до кінозалу великогабаритні речі. У випадку наявності у Відвідувача великої сумки чи пакету, працівники кінотеатру, з метою безпеки, мають право вимагати залишити сумки чи пакет у камері схову.
3.10. Згідно з постановою КМУ «Про державне посвідчення на право розповсюдження і демонстрування фільмів» №1315 від 17.08.1998 р. визначені такі індекси глядацької аудиторії:
«12+» — індекс, що встановлюється для фільмів, перегляд яких можливий дітьми від 12 років тільки в присутності батьків у зв’язку з тим, що такі фільми можуть містити деякі сцени, які батьки вважатимуть неприйнятними для самостійного перегляду дітей.

«16+» — індекс, що встановлюється для фільмів, перегляд яких забороняється особам віком до 16 років.
«18+» — індекс, що встановлюється для фільмів, перегляд яких забороняється особам віком до 18 років.
3.11. Проносити до кінозалу їжу типу: fast food, піца, японська їжа, кулінарія супермаркетів і т.п. та міцні алкогольні напої.
3.12. Відвідувати кінотеатр у робочій формі та/або брудному одязі.
3.13. Використовувати пересувний транспорт у фойє кінотеатру та кінозалах, а саме: гіроскутери, моноколесо, візки для перевезення продуктів харчування та побутових товарів тощо.

4. ВІДПОВІДАЛЬНІСТЬ ВІДВІДУВАЧІВ КІНОТЕАТРУ:
4.1. Відвідувачі кінотеатру зобов’язані дбайливо ставитись до майна кінотеатру, не допускати його пошкодження та знищення, зокрема не робити написів на майні кінотеатру. У разі нанесення збитків майну кінотеатру, Відвідувач відшкодовує суму збитків у повному обсязі.

4.2. Співробітник бару при продажу алкогольних напоїв (крім безалкогольного пива), має право перевірити в покупця паспорт або інші документи, що підтверджують вік покупця (якщо виникли сумніви щодо досягнення покупцем 18-річного віку). У разі відмови покупця надати такий документ, продаж алкогольних напоїв (крім безалкогольного пива) такій особі забороняється.
4.3. У разі придбання неякісних продовольчих товарів Відвідувач має право звернутися до адміністрації кінотеатру протягом 14 календарних днів з вимогою про повернення грошових коштів за неякісні продукти харчування.
4.4. У разі знаходження Відвідувачами кінотеатру підозрілого предмету (сумка, згорток, пакет, пакунок, валіза тощо) на території кінотеатру, останні повинні негайно повідомити про таку знахідку адміністрації або охороні кінотеатру.

5. ДОПОВНЕННЯ І РОЗ’ЯСНЕННЯ:
5.1. Купуючи квиток на перегляд фільму, Відвідувач підтверджує, що він ознайомлений та погоджується з Правилами роботи кінотеатру та інформацією про фільм.
5.2. Кінотеатр згідно ЗУ «Про рекламу» має право демонструвати рекламу перед початком фільму.
5.3. Відвідувачі кінотеатрів мережі «МУЛЬТИПЛЕКС» самостійно несуть відповідальність за збереження власних речей. У разі їх втрати адміністрація та працівники кінотеатру не несуть відповідальність за їх втрату та не відшкодовують вартість зниклих речей.
5.4. Речі до гардеробу приймаються виключно за наявності квитків на фільм. Пакети, парасольки, рюкзаки на зберігання не приймаються. Адміністрація не несе відповідальність за збереження речей, залишених у верхньому одязі. У випадку втрати гардеробного жетону, речі видаються за умови детального опису власником речі та за умови надання прізвища, ім’я по батькові, контактного телефону, та пред’явленні документу, що посвідчує особу*.
5.5. Адміністрація кінотеатру «МУЛЬТИПЛЕКС» не несе відповідальності за можливий дискомфорт для очей під час перегляду сеансу в 3D-форматі. Якщо у Відвідувача є проблеми із зором, йому необхідно отримати консультацію лікаря, перш ніж відвідувати кіносеанс.

5.6. Якщо Відвідувач користується окулярами, то 3D-окуляри або 3D-кліпси рекомендуємо одягати поверх на окуляри з діоптріями.
5.7. 3D-окуляри можуть бути використані лише для перегляду 3D-фільмів у 3D-кінозалі.
5.8. Кінотеатри мережі «МУЛЬТИПЛЕКС» надають можливість відвідувати кінозали за спеціальною ціною зі знижкою учням та студентам, за умови наявності відповідного посвідчення (учнівського квитка (або документу, що його замінює) та студентського квитка денної форми навчання). Продаж квитків зі знижкою можливий лише в касі кінотеатру. При демонстрації одного студентського квитка знижка надається на один квиток.
5.9. Відвідування кіносеансів дітям до 6 років може бути безкоштовним, якщо дитина не займає додаткового крісла в кінозалі. На одного дорослого передбачено одне безкоштовне місце для дитини до 6 років. У випадку відвідування фільму без вікових обмежень неповнолітніми особами, супроводжуючий має бути не молодше 14 років.
5.10. Мінімальний вік неповнолітньої особи, яка самостійно може відвідувати сеанси без вікового обмеження, становить 14 років.
5.11. Кінотеатр залишає за собою право здійснювати фото і відеофіксацію з метою запобігання камкордингу, вчинення правопорушень та кримінальних злочинів, а також — забезпечення безпеки Співробітників, Відвідувачів кінотеатру та Глядачів.
5.12. Відвідувачі кінотеатру перед придбанням квитка на перегляд фільму, зобов’язані ознайомитись з інформацією про фільм та рекомендаціями щодо вікових обмежень глядацької аудиторії. У разі недотримання Відвідувачами кінотеатру рекомендацій за віковими обмеженнями, кінотеатр не несе будь-якої відповідальності й уся відповідальність покладається на батьків або осіб, що їх замінюють.
5.13. Підписуючи Договір оферти, Відвідувач погоджується з Правилами роботи мережі кінотеатрів Мультиплекс, і згідно з Законом України «Про захист персональних даних», надає згоду на обробку персональних даних, а саме: назви, місцезнаходження, реєстраційних даних (коду ЄДРПОУ, номеру державної реєстрації у ЄДР), інформації щодо системи оподаткування (ІПН, реєстраційного номеру облікової картки платника податків, номеру свідоцтва про статус платника ПДВ), банківських реквізитів, електронних ідентифікаційних даних (IP-адреса, телефон, e-mail), прізвища, ім’я по батькові, особистого підпису та інших даних.
5.14. Відвідувач може вносити свої пропозиції та зауваження, зателефонувавши на гарячу лінію 0 800 505 333, через зворотній зв’язок на сайті multiplex.ua або через сервіс моментального зв’язку «Sarafan».

* Стосується кінотеатрів, де є гардероб.

Кінотеатр MULTIPLEX у Проспект Київ — придбати квиток у кінотеатр Проспект

З 14 грудня 2017 року у мережі кінотеатрів Multiplex відміняється послуга бронювання квитків. Це пов’язано з тим, що досить часто люди не встигають придбати квитки до зняття броні, або зовсім не приходять до кінотеатру. Тому інші глядачі не можуть обрати найкращі місця.
ПРАВИЛА РОБОТИ МЕРЕЖІ КІНОТЕАТРІВ «МУЛЬТИПЛЕКС»

ЗАГАЛЬНІ ПОЛОЖЕННЯ
Дані правила розроблені у відповідності до Цивільного Кодексу України, Закону України «Про кінематографію» та Закону України «Про захист прав споживачів».
Дані правила обов’язкові для дотримання всіма Відвідувачами мережі кінотеатрів «МУЛЬТИПЛЕКС».

1. ПРАВИЛА ВІДВІДУВАННЯ КІНОТЕАТРУ МЕРЕЖІ «МУЛЬТИПЛЕКС»:
1.1. Фільми, що демонструються в різних форматах, позначаються наступними значками: 2D, 3D, Twins, IMAX, ScreenX тощо.
1.2. Для перегляду фільмів у форматі 3D обов’язково необхідно мати при собі персональні 3D-окуляри. У разі відсутності 3D окулярів Відвідувач може придбати їх в касі кінотеатру або онлайн.
1.3. Продані в касі квитки підлягають поверненню або обміну виключно за наявності чеку на придбання квитків у касі кінотеатру.
1.4. Для оформлення повернення квитків, придбаних онлайн, необхідно заповнити форму на сайті, в розділі «Допомога» → «Купівля та повернення квитків» або в додатку в розділі «Повернення квитків».
1.5. Продані квитки підлягають поверненню тільки в наступних випадках: відміни сеансу (форс-мажор), ненадання інформації про вікові обмеження на перегляд фільму, заміни фільму або неякісної демонстрації з вини кінотеатру. При цьому, якщо Відвідувач прийняв рішення з якоїсь причини повернути квитки, рекомендуємо звернутися в касу не пізніше як за 30 хвилин до початку сеансу, щоб інші Відвідувачі могли скористатися цими місцями й відвідати кіносеанс.
1.6. Обмін квитка на наступний сеанс здійснюється в межах еквівалентної вартості квитка за наявності чеку придбання.
1.7. У разі запізнення Відвідувача на сеанс, неприбуття на кіносеанс чи відмови Відвідувача від перегляду фільму після початку кінофільму, квитки на цей сеанс не підлягають обміну або поверненню до каси.

2. УМОВИ ВІДВІДУВАННЯ КІНОЗАЛІВ:
2.1. Відвідувачі допускаються на територію кінотеатру тільки за наявності придбаного квитка та незчитаного QR-коду (не погашеного). Скануванню підлягають квитки в паперовому (друкованому) або електронному вигляді.
2.2. Відвідувачі повинні зберігати квитки (електронні/паперові) для контролю до кінця сеансу. Кінотеатр не зобов’язаний допускати Відвідувача на сеанс у випадку втрати квитка.
2.3. Відвідувач має можливість придбати квиток протягом 20 хвилин після початку сеансу та пройти до кінозалу протягом 30 хвилин після початку сеансу за наявності придбаного квитка на сеанс та незчитаного QR-коду.
2.4. Відвідувач має право перебувати лише на тому сеансі, на який було придбано квиток.
2.5. Адміністрація кінотеатру має право вимагати у Відвідувача пред’явити квиток під час сеансу для здійснення додаткового контролю.
2.6. У разі виходу Відвідувача із кінозалу під час сеансу, співробітник кінотеатру має право перевірити його квиток при поверненні до кінозалу, у разі відсутності квитка співробітник кінотеатру має право не допускати до кінозалу.
2.7. Квиток вважається недійсним при відсутності QR-коду.
2.8. Займати місця в залі необхідно згідно з нумерацією ряду та місця, зазначених у квитку.
2.9. У залі заборонено пересідати на інші місця під час сеансу.
2.10. У залах кінотеатру категорично забороняється проводити фото та відеозйомку, користуватися будь-якою записуючою апаратурою відповідно до Закону України «Про державну підтримку кінематографії України», Закону України «Про авторське право і суміжні права», Кодексу України про адміністративні правопорушення, Кримінального кодексу України.
2.11. Перебуваючи в кінозалі, рекомендовано переводити мобільний телефон у режим без звуку, щоб не заважати іншим Відвідувачам.
2.12. Категорія осіб, затверджених адміністрацією, має можливість придбати квитки зі знижкою/за зниженою ціною (за наявності відповідних документів).
2.13. Передбачені пільги можуть бути скасовані відповідно до вказівки власника прав (ліцензії) на прокат фільму, про що кінотеатр повідомляє шляхом розміщення оголошення на офіційному сайті компанії.

3. ЗАБОРОНЕНО:
3.1. Перебування на території кінотеатру осіб, що мають ознаки алкогольного та/або наркотичного сп’яніння.
3.2. Проносити до кінотеатру вогнепальну, газову та/або холодну зброю, спеціальні засоби, вибухові пристрої та піротехніку, газові балончики та пневматичну зброю. Виняток становлять працівники правоохоронних органів Збройних Сил України та Національної Гвардії України, які мають табельну зброю та відвідують кінотеатр з метою виконання службових обов’язків.
3.3. Згідно із Законом України «Про заходи щодо попередження та зменшення вживання тютюнових виробів і їх шкідливого впливу на здоров’я населення», забороняється палити. Також забороняється палити електронні цигарки, IQOS, Vape та інше в кінозалі та на території кінотеатру, крім спеціально відведених для паління місць на території торгово-розважального центру (надалі — ТРЦ).
3.4. Смітити й розкидати різні предмети (упаковки, жувальні гумки, серветки тощо).
3.5. Знаходитись на території кінотеатру з тваринами.
3.6. Перебування на території кінотеатру в нічний час (з 22:00 до 6:00), а також на сеансах, що закінчуються після 22:00 до 6:00, осіб, молодших за 16 років, без супроводу батьків, або осіб, що їх замінюють згідно із законодавством.
3.7. Нецензурно лаятися, грати в азартні ігри, агресивно поводитися, порушувати тишу, використовувати предмети, що створюють шумовий ефект та заважають відпочинку інших Відвідувачів кінотеатру. Працівники кінотеатру мають право самостійно або із залученням представників служби охорони вивести правопорушників із кінозалу або кінотеатру, а також викликати поліцію для усунення правопорушення. У такому разі кінотеатр не зобов’язаний компенсувати вартість придбаного Відвідувачем Квитка.
3.8. Створювати перешкоди в роботі співробітникам кінотеатру, входити до службових та технічних приміщень.
3.9. Проносити до кінозалу великогабаритні речі. У випадку наявності у Відвідувача великої сумки чи пакету, працівники кінотеатру, з метою безпеки, мають право вимагати залишити сумки чи пакет у камері схову.
3.10. Згідно з постановою КМУ «Про державне посвідчення на право розповсюдження і демонстрування фільмів» №1315 від 17.08.1998 р. визначені такі індекси глядацької аудиторії:
«12+» — індекс, що встановлюється для фільмів, перегляд яких можливий дітьми від 12 років тільки в присутності батьків у зв’язку з тим, що такі фільми можуть містити деякі сцени, які батьки вважатимуть неприйнятними для самостійного перегляду дітей.
«16+» — індекс, що встановлюється для фільмів, перегляд яких забороняється особам віком до 16 років.
«18+» — індекс, що встановлюється для фільмів, перегляд яких забороняється особам віком до 18 років.
3.11. Проносити до кінозалу їжу типу: fast food, піца, японська їжа, кулінарія супермаркетів і т.п. та міцні алкогольні напої.
3.12. Відвідувати кінотеатр у робочій формі та/або брудному одязі.
3.13. Використовувати пересувний транспорт у фойє кінотеатру та кінозалах, а саме: гіроскутери, моноколесо, візки для перевезення продуктів харчування та побутових товарів тощо.

4. ВІДПОВІДАЛЬНІСТЬ ВІДВІДУВАЧІВ КІНОТЕАТРУ:
4.1. Відвідувачі кінотеатру зобов’язані дбайливо ставитись до майна кінотеатру, не допускати його пошкодження та знищення, зокрема не робити написів на майні кінотеатру. У разі нанесення збитків майну кінотеатру, Відвідувач відшкодовує суму збитків у повному обсязі.
4.2. Співробітник бару при продажу алкогольних напоїв (крім безалкогольного пива), має право перевірити в покупця паспорт або інші документи, що підтверджують вік покупця (якщо виникли сумніви щодо досягнення покупцем 18-річного віку). У разі відмови покупця надати такий документ, продаж алкогольних напоїв (крім безалкогольного пива) такій особі забороняється.
4.3. У разі придбання неякісних продовольчих товарів Відвідувач має право звернутися до адміністрації кінотеатру протягом 14 календарних днів з вимогою про повернення грошових коштів за неякісні продукти харчування.
4.4. У разі знаходження Відвідувачами кінотеатру підозрілого предмету (сумка, згорток, пакет, пакунок, валіза тощо) на території кінотеатру, останні повинні негайно повідомити про таку знахідку адміністрації або охороні кінотеатру.

5. ДОПОВНЕННЯ І РОЗ’ЯСНЕННЯ:
5.1. Купуючи квиток на перегляд фільму, Відвідувач підтверджує, що він ознайомлений та погоджується з Правилами роботи кінотеатру та інформацією про фільм.
5.2. Кінотеатр згідно ЗУ «Про рекламу» має право демонструвати рекламу перед початком фільму.
5.3. Відвідувачі кінотеатрів мережі «МУЛЬТИПЛЕКС» самостійно несуть відповідальність за збереження власних речей. У разі їх втрати адміністрація та працівники кінотеатру не несуть відповідальність за їх втрату та не відшкодовують вартість зниклих речей.
5.4. Речі до гардеробу приймаються виключно за наявності квитків на фільм. Пакети, парасольки, рюкзаки на зберігання не приймаються. Адміністрація не несе відповідальність за збереження речей, залишених у верхньому одязі. У випадку втрати гардеробного жетону, речі видаються за умови детального опису власником речі та за умови надання прізвища, ім’я по батькові, контактного телефону, та пред’явленні документу, що посвідчує особу*.
5.5. Адміністрація кінотеатру «МУЛЬТИПЛЕКС» не несе відповідальності за можливий дискомфорт для очей під час перегляду сеансу в 3D-форматі. Якщо у Відвідувача є проблеми із зором, йому необхідно отримати консультацію лікаря, перш ніж відвідувати кіносеанс.
5.6. Якщо Відвідувач користується окулярами, то 3D-окуляри або 3D-кліпси рекомендуємо одягати поверх на окуляри з діоптріями.
5.7. 3D-окуляри можуть бути використані лише для перегляду 3D-фільмів у 3D-кінозалі.
5.8. Кінотеатри мережі «МУЛЬТИПЛЕКС» надають можливість відвідувати кінозали за спеціальною ціною зі знижкою учням та студентам, за умови наявності відповідного посвідчення (учнівського квитка (або документу, що його замінює) та студентського квитка денної форми навчання). Продаж квитків зі знижкою можливий лише в касі кінотеатру. При демонстрації одного студентського квитка знижка надається на один квиток.
5.9. Відвідування кіносеансів дітям до 6 років може бути безкоштовним, якщо дитина не займає додаткового крісла в кінозалі. На одного дорослого передбачено одне безкоштовне місце для дитини до 6 років. У випадку відвідування фільму без вікових обмежень неповнолітніми особами, супроводжуючий має бути не молодше 14 років.
5.10. Мінімальний вік неповнолітньої особи, яка самостійно може відвідувати сеанси без вікового обмеження, становить 14 років.
5.11. Кінотеатр залишає за собою право здійснювати фото і відеофіксацію з метою запобігання камкордингу, вчинення правопорушень та кримінальних злочинів, а також — забезпечення безпеки Співробітників, Відвідувачів кінотеатру та Глядачів.
5.12. Відвідувачі кінотеатру перед придбанням квитка на перегляд фільму, зобов’язані ознайомитись з інформацією про фільм та рекомендаціями щодо вікових обмежень глядацької аудиторії. У разі недотримання Відвідувачами кінотеатру рекомендацій за віковими обмеженнями, кінотеатр не несе будь-якої відповідальності й уся відповідальність покладається на батьків або осіб, що їх замінюють.
5.13. Підписуючи Договір оферти, Відвідувач погоджується з Правилами роботи мережі кінотеатрів Мультиплекс, і згідно з Законом України «Про захист персональних даних», надає згоду на обробку персональних даних, а саме: назви, місцезнаходження, реєстраційних даних (коду ЄДРПОУ, номеру державної реєстрації у ЄДР), інформації щодо системи оподаткування (ІПН, реєстраційного номеру облікової картки платника податків, номеру свідоцтва про статус платника ПДВ), банківських реквізитів, електронних ідентифікаційних даних (IP-адреса, телефон, e-mail), прізвища, ім’я по батькові, особистого підпису та інших даних.
5.14. Відвідувач може вносити свої пропозиції та зауваження, зателефонувавши на гарячу лінію 0 800 505 333, через зворотній зв’язок на сайті multiplex.ua або через сервіс моментального зв’язку «Sarafan».

* Стосується кінотеатрів, де є гардероб.

Кінотеатр MULTIPLEX у ПортCity Маріуполь — придбати квиток у кінотеатр ПортCity

З 14 грудня 2017 року у мережі кінотеатрів Multiplex відміняється послуга бронювання квитків. Це пов’язано з тим, що досить часто люди не встигають придбати квитки до зняття броні, або зовсім не приходять до кінотеатру. Тому інші глядачі не можуть обрати найкращі місця.
ПРАВИЛА РОБОТИ МЕРЕЖІ КІНОТЕАТРІВ «МУЛЬТИПЛЕКС»

ЗАГАЛЬНІ ПОЛОЖЕННЯ
Дані правила розроблені у відповідності до Цивільного Кодексу України, Закону України «Про кінематографію» та Закону України «Про захист прав споживачів».
Дані правила обов’язкові для дотримання всіма Відвідувачами мережі кінотеатрів «МУЛЬТИПЛЕКС».

1. ПРАВИЛА ВІДВІДУВАННЯ КІНОТЕАТРУ МЕРЕЖІ «МУЛЬТИПЛЕКС»:
1.1. Фільми, що демонструються в різних форматах, позначаються наступними значками: 2D, 3D, Twins, IMAX, ScreenX тощо.
1.2. Для перегляду фільмів у форматі 3D обов’язково необхідно мати при собі персональні 3D-окуляри. У разі відсутності 3D окулярів Відвідувач може придбати їх в касі кінотеатру або онлайн.
1.3. Продані в касі квитки підлягають поверненню або обміну виключно за наявності чеку на придбання квитків у касі кінотеатру.
1.4. Для оформлення повернення квитків, придбаних онлайн, необхідно заповнити форму на сайті, в розділі «Допомога» → «Купівля та повернення квитків» або в додатку в розділі «Повернення квитків».
1.5. Продані квитки підлягають поверненню тільки в наступних випадках: відміни сеансу (форс-мажор), ненадання інформації про вікові обмеження на перегляд фільму, заміни фільму або неякісної демонстрації з вини кінотеатру. При цьому, якщо Відвідувач прийняв рішення з якоїсь причини повернути квитки, рекомендуємо звернутися в касу не пізніше як за 30 хвилин до початку сеансу, щоб інші Відвідувачі могли скористатися цими місцями й відвідати кіносеанс.
1.6. Обмін квитка на наступний сеанс здійснюється в межах еквівалентної вартості квитка за наявності чеку придбання.
1.7. У разі запізнення Відвідувача на сеанс, неприбуття на кіносеанс чи відмови Відвідувача від перегляду фільму після початку кінофільму, квитки на цей сеанс не підлягають обміну або поверненню до каси.

2. УМОВИ ВІДВІДУВАННЯ КІНОЗАЛІВ:
2.1. Відвідувачі допускаються на територію кінотеатру тільки за наявності придбаного квитка та незчитаного QR-коду (не погашеного). Скануванню підлягають квитки в паперовому (друкованому) або електронному вигляді.
2.2. Відвідувачі повинні зберігати квитки (електронні/паперові) для контролю до кінця сеансу. Кінотеатр не зобов’язаний допускати Відвідувача на сеанс у випадку втрати квитка.
2.3. Відвідувач має можливість придбати квиток протягом 20 хвилин після початку сеансу та пройти до кінозалу протягом 30 хвилин після початку сеансу за наявності придбаного квитка на сеанс та незчитаного QR-коду.
2.4. Відвідувач має право перебувати лише на тому сеансі, на який було придбано квиток.
2.5. Адміністрація кінотеатру має право вимагати у Відвідувача пред’явити квиток під час сеансу для здійснення додаткового контролю.
2.6. У разі виходу Відвідувача із кінозалу під час сеансу, співробітник кінотеатру має право перевірити його квиток при поверненні до кінозалу, у разі відсутності квитка співробітник кінотеатру має право не допускати до кінозалу.
2.7. Квиток вважається недійсним при відсутності QR-коду.
2.8. Займати місця в залі необхідно згідно з нумерацією ряду та місця, зазначених у квитку.
2.9. У залі заборонено пересідати на інші місця під час сеансу.
2.10. У залах кінотеатру категорично забороняється проводити фото та відеозйомку, користуватися будь-якою записуючою апаратурою відповідно до Закону України «Про державну підтримку кінематографії України», Закону України «Про авторське право і суміжні права», Кодексу України про адміністративні правопорушення, Кримінального кодексу України.
2.11. Перебуваючи в кінозалі, рекомендовано переводити мобільний телефон у режим без звуку, щоб не заважати іншим Відвідувачам.
2.12. Категорія осіб, затверджених адміністрацією, має можливість придбати квитки зі знижкою/за зниженою ціною (за наявності відповідних документів).
2.13. Передбачені пільги можуть бути скасовані відповідно до вказівки власника прав (ліцензії) на прокат фільму, про що кінотеатр повідомляє шляхом розміщення оголошення на офіційному сайті компанії.

3. ЗАБОРОНЕНО:
3.1. Перебування на території кінотеатру осіб, що мають ознаки алкогольного та/або наркотичного сп’яніння.
3.2. Проносити до кінотеатру вогнепальну, газову та/або холодну зброю, спеціальні засоби, вибухові пристрої та піротехніку, газові балончики та пневматичну зброю. Виняток становлять працівники правоохоронних органів Збройних Сил України та Національної Гвардії України, які мають табельну зброю та відвідують кінотеатр з метою виконання службових обов’язків.
3.3. Згідно із Законом України «Про заходи щодо попередження та зменшення вживання тютюнових виробів і їх шкідливого впливу на здоров’я населення», забороняється палити. Також забороняється палити електронні цигарки, IQOS, Vape та інше в кінозалі та на території кінотеатру, крім спеціально відведених для паління місць на території торгово-розважального центру (надалі — ТРЦ).
3.4. Смітити й розкидати різні предмети (упаковки, жувальні гумки, серветки тощо).
3.5. Знаходитись на території кінотеатру з тваринами.
3.6. Перебування на території кінотеатру в нічний час (з 22:00 до 6:00), а також на сеансах, що закінчуються після 22:00 до 6:00, осіб, молодших за 16 років, без супроводу батьків, або осіб, що їх замінюють згідно із законодавством.
3.7. Нецензурно лаятися, грати в азартні ігри, агресивно поводитися, порушувати тишу, використовувати предмети, що створюють шумовий ефект та заважають відпочинку інших Відвідувачів кінотеатру. Працівники кінотеатру мають право самостійно або із залученням представників служби охорони вивести правопорушників із кінозалу або кінотеатру, а також викликати поліцію для усунення правопорушення. У такому разі кінотеатр не зобов’язаний компенсувати вартість придбаного Відвідувачем Квитка.
3.8. Створювати перешкоди в роботі співробітникам кінотеатру, входити до службових та технічних приміщень.
3.9. Проносити до кінозалу великогабаритні речі. У випадку наявності у Відвідувача великої сумки чи пакету, працівники кінотеатру, з метою безпеки, мають право вимагати залишити сумки чи пакет у камері схову.
3.10. Згідно з постановою КМУ «Про державне посвідчення на право розповсюдження і демонстрування фільмів» №1315 від 17.08.1998 р. визначені такі індекси глядацької аудиторії:
«12+» — індекс, що встановлюється для фільмів, перегляд яких можливий дітьми від 12 років тільки в присутності батьків у зв’язку з тим, що такі фільми можуть містити деякі сцени, які батьки вважатимуть неприйнятними для самостійного перегляду дітей.
«16+» — індекс, що встановлюється для фільмів, перегляд яких забороняється особам віком до 16 років.
«18+» — індекс, що встановлюється для фільмів, перегляд яких забороняється особам віком до 18 років.
3.11. Проносити до кінозалу їжу типу: fast food, піца, японська їжа, кулінарія супермаркетів і т.п. та міцні алкогольні напої.
3.12. Відвідувати кінотеатр у робочій формі та/або брудному одязі.
3.13. Використовувати пересувний транспорт у фойє кінотеатру та кінозалах, а саме: гіроскутери, моноколесо, візки для перевезення продуктів харчування та побутових товарів тощо.

4. ВІДПОВІДАЛЬНІСТЬ ВІДВІДУВАЧІВ КІНОТЕАТРУ:
4.1. Відвідувачі кінотеатру зобов’язані дбайливо ставитись до майна кінотеатру, не допускати його пошкодження та знищення, зокрема не робити написів на майні кінотеатру. У разі нанесення збитків майну кінотеатру, Відвідувач відшкодовує суму збитків у повному обсязі.
4.2. Співробітник бару при продажу алкогольних напоїв (крім безалкогольного пива), має право перевірити в покупця паспорт або інші документи, що підтверджують вік покупця (якщо виникли сумніви щодо досягнення покупцем 18-річного віку). У разі відмови покупця надати такий документ, продаж алкогольних напоїв (крім безалкогольного пива) такій особі забороняється.
4.3. У разі придбання неякісних продовольчих товарів Відвідувач має право звернутися до адміністрації кінотеатру протягом 14 календарних днів з вимогою про повернення грошових коштів за неякісні продукти харчування.
4.4. У разі знаходження Відвідувачами кінотеатру підозрілого предмету (сумка, згорток, пакет, пакунок, валіза тощо) на території кінотеатру, останні повинні негайно повідомити про таку знахідку адміністрації або охороні кінотеатру.

5. ДОПОВНЕННЯ І РОЗ’ЯСНЕННЯ:
5.1. Купуючи квиток на перегляд фільму, Відвідувач підтверджує, що він ознайомлений та погоджується з Правилами роботи кінотеатру та інформацією про фільм.
5.2. Кінотеатр згідно ЗУ «Про рекламу» має право демонструвати рекламу перед початком фільму.
5.3. Відвідувачі кінотеатрів мережі «МУЛЬТИПЛЕКС» самостійно несуть відповідальність за збереження власних речей. У разі їх втрати адміністрація та працівники кінотеатру не несуть відповідальність за їх втрату та не відшкодовують вартість зниклих речей.
5.4. Речі до гардеробу приймаються виключно за наявності квитків на фільм. Пакети, парасольки, рюкзаки на зберігання не приймаються. Адміністрація не несе відповідальність за збереження речей, залишених у верхньому одязі. У випадку втрати гардеробного жетону, речі видаються за умови детального опису власником речі та за умови надання прізвища, ім’я по батькові, контактного телефону, та пред’явленні документу, що посвідчує особу*.
5.5. Адміністрація кінотеатру «МУЛЬТИПЛЕКС» не несе відповідальності за можливий дискомфорт для очей під час перегляду сеансу в 3D-форматі. Якщо у Відвідувача є проблеми із зором, йому необхідно отримати консультацію лікаря, перш ніж відвідувати кіносеанс.
5.6. Якщо Відвідувач користується окулярами, то 3D-окуляри або 3D-кліпси рекомендуємо одягати поверх на окуляри з діоптріями.
5.7. 3D-окуляри можуть бути використані лише для перегляду 3D-фільмів у 3D-кінозалі.
5.8. Кінотеатри мережі «МУЛЬТИПЛЕКС» надають можливість відвідувати кінозали за спеціальною ціною зі знижкою учням та студентам, за умови наявності відповідного посвідчення (учнівського квитка (або документу, що його замінює) та студентського квитка денної форми навчання). Продаж квитків зі знижкою можливий лише в касі кінотеатру. При демонстрації одного студентського квитка знижка надається на один квиток.
5.9. Відвідування кіносеансів дітям до 6 років може бути безкоштовним, якщо дитина не займає додаткового крісла в кінозалі. На одного дорослого передбачено одне безкоштовне місце для дитини до 6 років. У випадку відвідування фільму без вікових обмежень неповнолітніми особами, супроводжуючий має бути не молодше 14 років.
5.10. Мінімальний вік неповнолітньої особи, яка самостійно може відвідувати сеанси без вікового обмеження, становить 14 років.
5.11. Кінотеатр залишає за собою право здійснювати фото і відеофіксацію з метою запобігання камкордингу, вчинення правопорушень та кримінальних злочинів, а також — забезпечення безпеки Співробітників, Відвідувачів кінотеатру та Глядачів.
5.12. Відвідувачі кінотеатру перед придбанням квитка на перегляд фільму, зобов’язані ознайомитись з інформацією про фільм та рекомендаціями щодо вікових обмежень глядацької аудиторії. У разі недотримання Відвідувачами кінотеатру рекомендацій за віковими обмеженнями, кінотеатр не несе будь-якої відповідальності й уся відповідальність покладається на батьків або осіб, що їх замінюють.
5.13. Підписуючи Договір оферти, Відвідувач погоджується з Правилами роботи мережі кінотеатрів Мультиплекс, і згідно з Законом України «Про захист персональних даних», надає згоду на обробку персональних даних, а саме: назви, місцезнаходження, реєстраційних даних (коду ЄДРПОУ, номеру державної реєстрації у ЄДР), інформації щодо системи оподаткування (ІПН, реєстраційного номеру облікової картки платника податків, номеру свідоцтва про статус платника ПДВ), банківських реквізитів, електронних ідентифікаційних даних (IP-адреса, телефон, e-mail), прізвища, ім’я по батькові, особистого підпису та інших даних.
5.14. Відвідувач може вносити свої пропозиції та зауваження, зателефонувавши на гарячу лінію 0 800 505 333, через зворотній зв’язок на сайті multiplex.ua або через сервіс моментального зв’язку «Sarafan».

* Стосується кінотеатрів, де є гардероб.

20 телеканалов свободного доступа | Цифровое эфирное телевидение

МУЛЬТИПЛЕКС РТРС-1: СПИСОК ТЕЛЕКАНАЛОВ

МУЛЬТИПЛЕКС РТРС-2: СПИСОК ТЕЛЕКАНАЛОВ

До 2010 года почти половина жителей России (44%) могла принимать не более четырех телеканалов. При этом возможности развития аналогового вещания были исчерпаны. Благодаря внедрению цифровых технологий вещания к концу 2018 года 98,4% жителей страны могут бесплатно смотреть 10 телеканалов первого мультиплекса, более 98% телезрителей — 20 каналов первого и второго мультиплексов. 

Пакет цифровых каналов РТРС-1 (первый мультиплекс) включает общероссийские обязательные общедоступные телеканалы и радиоканалы. Перечень этих телерадиоканалов был определен Указом Президента РФ от 24 июня 2009 года № 715 «Об общероссийских обязательных общедоступных телеканалах и радиоканалах» и его последующими редакциями: Указом Президента РФ от 17 апреля 2012 года № 456, Указом Президента РФ от 20 апреля 2013 года № 367, Указом Президента РФ от 15 июля 2015 года № 365. Десять телеканалов для трансляции в составе пакета РТРС-2 (второй мультиплекс) отобрала Федеральная конкурсная комиссия по телерадиовещанию (14 декабря 2012 года, 18 декабря 2013 года и 30 сентября 2015 года). Цифровые телеканалы транслируются в стандарте DVB-T2.

Напоминаем, что в соответствии с Законом «О средствах массовой информации» в редакции от 13 июля 2015 года телеканалы и радиоканалы, получившие право на цифровое эфирное вещание с использованием позиций в мультиплексах на всей территории Российской Федерации, отнесены к обязательным общедоступным телеканалам и радиоканалам. Обязательные общедоступные телеканалы и радиоканалы подлежат распространению во всех средах вещания без взимания платы с потребителей (телезрителей, радиослушателей) за право просмотра и прослушивания.

Что такое мультиплекс в цифровом телевидении?

Мультиплекс – пакет цифровых телевизионных каналов, транслирующийся одним передатчиком. Обычно занимает одну частоту. В цифровом эфирном телевидении мультиплекс включает 10 телеканалов.

FAQ Часто задаваемые вопросы — Цифровое эфирное телевидение

Зачем Россия переходит на цифровое эфирное телевидение?

Федеральная целевая программа решает в первую очередь важную социальную задачу – делает доступными и бесплатными для всех жителей России 20 федеральных телеканалов в высоком «цифровом» качестве. Сделать это на базе аналогового телевидения нельзя по причине высоких затрат на его содержание и модернизацию, а также по причине ограниченности свободного радиочастотного ресурса. Для миллионов россиян цифровое эфирное телевидение будет означать улучшение качества жизни и устранение информационного неравенства.

Чем цифровое эфирное телевидение лучше аналогового?

Цифровое эфирное телевизионное вещание позволяет существенно повысить качество изображения и звука, расширить число доступных населению телеканалов, экономить частотный ресурс, а также предоставляет возможность развития новых современных услуг.

В чем преимущество ЦЭТВ от РТРС перед предложениями коммерческих операторов телевидения?

Преимущество цифрового эфирного телевидения РТРС – отсутствие абонентской платы за основные обязательные общедоступные каналы первого и второго мультиплексов.

Почему в моем населенном пункте отключили пакет цифровых телеканалов РТРС-2 (второй мультиплекс)?

Постановлением Правительства Российской Федерации от 29.08.2015 № 911 внесены изменения в федеральную целевую программу «Развитие телерадиовещания в Российской Федерации на 2009-2015 годы», продлевающие срок реализации мероприятия по строительству сети второго мультиплекса до 2018 года. В условиях параллельной аналоговой и цифровой трансляции существенно возрастает финансовая нагрузка на вещателей второго мультиплекса. В целях сокращения расходов телеканалов темпы строительства объектов второго мультиплекса были скорректированы и предусматривают запуск трансляции каналов второго мультиплекса только в городах с населением более 50 тысяч человек. Ранее построенные объекты связи переводятся в режим ожидания до 2019 года.

Когда будет отключено аналоговое телевещание по всей стране?

Принудительного отключения аналоговых телеканалов не планируется. Президент РФ Владимир Путин утвердил изменения в Указе № 715 «Об общероссийских обязательных общедоступных телеканалах и радиоканалах». Редакция документа, определяющего развитие российского телерадиовещания, закрепляет сохранение аналоговой трансляции основных российских телеканалов до 2018 года включительно. Для обеспечения параллельной трансляции в аналоговом и цифровом форматах Правительство Российской Федерации предоставит общероссийским обязательным общедоступным телеканалам и радиоканалам субсидии на цели аналогового эфирного распространения сигнала в населенных пунктах с численностью менее 100 тысяч жителей до 2018 года включительно. Предполагается, что телеканалы при желании смогут продолжить вещание в аналоговом формате и после 2018 года. Аналоговый формат вещания сохранится до тех пор, пока в нем будет необходимость у телезрителей и вещателей

Какое приемное оборудование необходимо?

Подключение оборудования для просмотра цифрового эфирного телевидения не занимает много времени и не требует специальных навыков и знаний. Для приема ЦЭТВ на новом телевизоре с поддержкой стандарта DVB-T2 нужна лишь антенна ДМВ диапазона. Для старого аналогового телевизора, кроме антенны, нужна специальная приставка (SetTopBox, STB, или просто «цифровая приставка»).

Дольщикам ЖК «Мультиплекс Кино» в Краснодаре представили новую компанию-подрядчика :: Krd.ru

В Краснодаре прошла встреча инициативной группы дольщиков жилого комплекса «Мультиплекс Кино» с представителями администрации города, руководителем компании-инвестора и генподрядчика. Обсудили текущую ситуацию на объекте и план действий по его достройке.

— Встречи с дольщиками мы проводим регулярно, администрация города продолжает держать ситуацию с достройкой ЖК «Мультиплекс Кино» на контроле. Сегодня компания-инвестор вместе с новый генподрядчиком обсудили с текущую ситуацию на объекте, рассказали о том, что сделано, наметили план дальнейших мероприятий по достройке жилого комплекса, — сказал заместитель директора департамента строительства Александр Мадовский.

Во встрече приняли участие около 100 дольщиков, генеральный директор компании-инвестораООО «Телекомстрой» Тимур Разакбердиев, генеральный директор ООО «ВК Строй» Виталий Ким, арбитражный управляющий Николай Адамов, а также представители департамента по надзору в строительной сфере Краснодарского края.

Жилой комплекс «Мультиплекс Кино» по ул. Уральской, 100 и 100/5 состоит из двух 5-секционных20-ти и 21-этажных648-квартирных жилых домов. Застройщик — ООО «Юг-ГарантСтрой». Строительство начали в 2014 г., в 2016 г. работы на стройплощадке остановили. В отношении застройщика и генподрядчика возбуждено уголовное дело.

Литер 1 по ул. Уральской, 100 готов на 60% — возведен монолитный каркас (22 этажа), частично выполнена кладка стен и установка окон. Строительная готовность второго литера по ул. Уральской, 100/5 составляет 40%. Возведён монолитный каркас здания на уровне 12-го этажа. Своих квартир ждут в литерах ждут более 1 тыс. дольщиков.

В 2018 г. ответственность по достройке взял на себя новый инвестор — ООО «Телекомстрой».

В 2020 г. для работ на объекте привлекли нового генподрядчика — компанию «ВК Строй». Как пояснил на встрече с дольщиками ее руководитель Виталий Ким, для активного возобновления строительно-монтажных работ необходимо изучить проектную, рабочую, сметную и исполнительную документацию, договоры на присоединение к инженерным сетям, которая была изъята в рамках уголовного дела. Их предоставили накануне, 14 июля.
Изучение документации займет около трех недель. Затем — ориентировочно 5 августа — пройдет следующая встреча с дольщиками. На ней подрядчик представит дольщикам поэтапный план работ на ближайшие месяцы.

Читайте новости Краснодара в нашем канале Telegram

Почему пропадает телесигнал. Советы по восстановлению приема цифрового ТВ

98% проблем зрителей с цифровым эфирным телевидением связаны с пользовательским оборудованием или условиями приема: расположением дома, рельефом, застройкой, а летом еще и с распустившейся листвой.

На основе данных горячей линии специалисты РТРС составили Топ-5 проблем телезрителей и предлагают способы их решения

1. «Усы» и «сушилки», или неподходящая антенна

«Первый мультиплекс не работает, второй с помехами», — так начинаются многие жалобы на горячую линию. Первым делом важно понять, какая у зрителя антенна. Типичный ответ: «Я не знаю, какая у меня стоит антенна. Она висит очень высоко на сосне, и ставили много лет назад».

Немного теории. Цифровое эфирное телевидение показывает без помех, оно либо есть в отличном качестве, либо его нет совсем. Поэтому в случаях, когда картинка на экране то четкая, то полностью пропадает, диагноз ясен: антенна принимает сигнал на пределе своих возможностей. И любое изменение условий приема — распустившиеся листья, дождь, проехавшая мимо машина — изменяет сигнал до такого уровня, что его мощности для этой антенны уже не хватает. В аналоговом телевидении на экране пошли бы помехи. «Цифра» исчезает совсем. Вывод прост: надо подобрать подходящую для вашего места антенну, чтобы она давала телевизору или приставке сигнал достаточной мощности.

Антенны бывают комнатные и наружные. Комнатная размещается в квартире и подходит, если телебашня расположена в прямой видимости. Если расстояние до башни более 10 км, нужна наружная. Ее устанавливают на балконе, фасаде или крыше.

По принимаемым частотам антенны делятся на метровые (аналоговые каналы), дециметровые (цифровые каналы) и всеволновые («аналог» и «цифра»). К 2019 году более 12 млн россиян принимали «аналог» в метровом диапазоне: например, на антенны типа «усы» или «полька» («сушилка»). Для приема «цифры» они неэффективны. Те, кто не успел обновить свое оборудование и попытался настроить «цифру» на новом приемнике со старой антенной, столкнулись с тем же самым периодическим пропаданием телесигнала. Прежняя антенна что-то ловит, но не всегда. Проблему решает только замена антенны на дециметровую. Самый подходящий тип — «елка».

Реже трудности с приемом возникают из-за переусиления сигнала. По типу усиления выделяют активные антенны (с усилителем) и пассивные (без него). Избыточное усиление вызывает помехи. Поэтому не стоит использовать активную антенну вблизи башни. Усилитель необходим на даче, в сельской местности, на большом расстоянии от башни в городе.

Если тип антенны не подходит под условия приема, лучше заменить ее.

2. «Поворот не туда», или неверная ориентация антенны

Проблема недостаточного сигнала может быть вызвана тем, что приемная антенна «смотрит не туда». Зритель из Железноводска сетовал на кратковременные прерывания и зависания сигнала. Оказалось, что антенна повернута в противоположную от городской телебашни сторону. Из-за этого уровень сигнала был слабый, а уровень ошибок, наоборот, высокий. Та же самая проблема — малейшее изменение условий приема, и сигнал пропадает. Разворот антенны решил проблему. И такие случаи встречаются регулярно.

Сориентировать антенну на ближайшую башню поможет интерактивная карта на сайте ртрс.рф. После подключения к телевизору (или приставке) с помощью кабеля следите за показателями уровня и качества сигнала на телеэкране. Медленно поворачивайте антенну вокруг своей оси. Ориентируйтесь на шкалы интенсивности и качества телесигнала. Добейтесь наилучших показателей: уровень сигнала — не менее 60%, качество — 100%.

Иногда «поворот не туда» не приводит к сбоям, но лишает местных новостей. Телезритель из деревни Пижма в Марий Эл направил антенну в сторону Санчурска (Кировская область) и получил в эфире кировские новости. Для просмотра марийских местных программ ему пришлось повернуть антенну в сторону Йошкар-Олы.

3. «Знай ее место», или неверное размещение антенны

«Показатели приема мультиплексов изменяются от 0% до 75%», — пишет телезритель. Оказалось, что его частный дом расположен в 50 метрах от густого леса, и антенна установлена на уровне шести метров от земли.

Подъем антенны выше часто решает проблему с приемом. На больших расстояниях от телебашни и рядом с естественными преградами рекомендуемая высота размещения антенны — 10 метров от уровня земли.

Не стоит ставить антенну на чердаке под крышей из металлочерепицы: эта экранирующая поверхность препятствует прохождению сигнала.

В случае с комнатной антенной лучше всего подойдет подоконник окна, которое выходит в сторону башни. Если такого окна нет, рекомендуется принять отраженный сигнал. Например, направить антенну на стену соседнего дома. Иногда придется перенести антенну в другую комнату.

4. Ложки, вилки и пивные банки, или о недостатках самодельных антенн

Жителю поселка Ерофей Павлович Амурской области удалось принять ТВ на столовую ложку, но сигнал то и дело исчезал.

Самоделки также готовят из алюминиевых столовых вилок, из задних решеток холодильников, из прокладок головки блока двигателя внутреннего сгорания, из сварочных электродов, из рыболовной сети, из гимнастических обручей и даже из пивных банок.

Удачные модели встречаются, но редко, так как требуют достаточных знаний в области физики и радиотехники. Для уверенного приема телесигнала рекомендуется принимать сигнал не «на проволочку», а на заводскую сертифицированную антенну.

5. Береги кабель снову, или почему важно проверять соединения

Если пропал сигнал, стоит проверить места соединений кабеля между антенной и приемником. Известен случай, когда телезритель зажал антенный кабель мешком картошки. Кабель отсоединился от телевизора, и сигнал пропал. Зритель обнаружил это спустя неделю без ТВ.

Чем плотнее оплетка кабеля и чем толще центральная жила, тем кабель прочнее.

Причиной неустойчивого приема ТВ может быть поврежденный — окисленный — разъем на телевизоре, к которому присоединяется антенный кабель. Если очистить места присоединений и заменить разъем, прием телеканалов восстановится.

В случае проблем с приемом ТВ рекомендуется проверить и место подсоединения антенного кабеля к наружной антенне, установленной на крыше дома. Там разъем не менее подвержен окислению.

6. Сложности с приставкой

Перенастройка, или как вернуть каналы в строй

Выпадение телеканалов — типичная проблема телезрителей, обращающихся на горлинию. Чаще всего у телезрителей исчезает один телеканал, реже — несколько. Например, у владельцев приставок Oriel 890 из мультиплекса пропадал «Матч ТВ». В таких случаях рекомендуется повторно настроить каналы на приставке. Для этого нужно зайти в раздел «Поиск каналов» и нажать «Автопоиск».

Приставки моделей Telefunken 212 и MDI DBR-701 не могли найти телеканал ОТР (о таких случаях сообщали из Кирова и из Смоленска). Помог только сброс настроек. В этом случае нужно выбрать в меню раздел «Система» — «Восстановить заводские настройки» и нажать «ОК». Далее вводим на месте пароля четыре нуля и снова пробуем запустить автопоиск.

У зрителя из Саратовской области телеканал «Карусель» показывался в формате «немого кино». После перенастройки звук возобновился.

Иногда автопоиск настраивает прием на частоты ретрансляторов соседних регионов. Например, на «России 1» передаются новости соседнего, а не своего региона. В таком случае пробуем настроить ТВ вручную. Для этого вводим частотный канал нужного мультиплекса (ТВК). Его легко найти на сайте РТРС и в мобильном приложении «Телегид» или узнать по номеру горлинии 8-800-220-20-02.

Неконструктивное поведение, или перегрев корпуса

Причиной пропадания сигнала может стать перегрев процессора. С такой проблемой сталкиваются владельцы недорогих моделей с конструктивными недоработками, например, Denn DDT104. Часто перегреваются приставки с встроенным блоком питания: DColor DC711HD, D-Color DC901HD, D-Color DC922HD и другие. Зафиксированы случаи перегрева модели MDI DBR-901.

Лучше всего вернуть такую приставку по гарантии и купить другую, более надежную модель. При этом стоит выбирать модели с внешним блоком питания — его легко заменить в случае поломки.

Если средства ограничены, можно просверлить вентиляционные отверстия в корпусе. Это должно снизить уровень нагрева. Однако это не универсальное решение.

«Перепрошивка», или крепко шить — нечего чинить

Производители всех устройств, у которых есть программное обеспечение (ПО), постоянно совершенствуют его. Приставки — не исключение. Предыдущие версии устаревают. Поэтому нужно обновлять ПО («перепрошивать»).

Владельцы приставок Digifors HD 71 Plus и DColor DC711HD (из Краснодара и Кирова) не обнаружили в первом мультиплексе «России 1». Повторный поиск в обоих случаях не помог. Неполадку удалось устранить только с помощью «перепрошивки». Для этого телезрители обращались в сервисный центр производителя или обновляли ПО самостоятельно.

Чтобы своими силами перепрошить приставку, нужно:

· скачать загрузочные файлы с сайта производителя,

· форматировать флешку в файловую систему FAT или FAT32,

· записать файлы на флешку и вставить ее в приставку,

· пошагово выполнить команды по установке.

После этого приемник автоматически перезагрузится и включит первый по списку канал.

Материал подготовлен Министерством цифрового развития и связи НСО

Изменено 31.07.2020 09:49:03 Просмотров:

aMSGE: усовершенствованная мультиплексная сайт-специфическая геномная инженерия с ортогональными модульными рекомбиназами в актиномицетах

Основные моменты

•

Была создана инновационная методология для мультилокусной геномной интеграции генов / путей в микробных системах.

•

Для актиномицетов был разработан набор инструментов для интеграции с несколькими копиями, основанный на пяти ортогональных системах SSR.

•

Множественная сверхэкспрессия генов предсинтетического биосинтеза accA2BE облегчает биосинтез актинородина на 4. 6-кратный.

•

Стабильная амплификация 5-оксомилбемицина BGC привела к увеличению титров 5-оксомилбемицина на 185,6% (с 2,23 до 6,37 г / л).

Реферат

Хромосомная интеграция генов и путей имеет особое значение для крупномасштабной и долгосрочной ферментации в промышленной биотехнологии. Однако стабильная, многокопийная интеграция длинных сегментов ДНК (например, больших кластеров генов) остается сложной задачей. Здесь мы описываем набор инструментов plug-and-play, который позволяет осуществлять высокоэффективную, одноэтапную, мультилокусную интеграцию кластеров биосинтетических генов (БГК) природного продукта (NP) в актиномицетах на основе инновационной концепции «множественных интеграций». -множественные attB сайтов ».Этот набор инструментов состоит из 27 синтетических модульных плазмид, которые содержат модули одиночной или множественной интеграции (от двух до четырех), полученные из пяти систем ортогональной сайт-специфической рекомбинации (SSR). Модули мультиинтеграции могут быть легко лигированы в плазмиды, содержащие большие BGC, посредством сборки Гибсона, которые могут быть одновременно вставлены во множество нативных сайтов attB за один шаг. Мы продемонстрировали применимость этого инструментария, выполнив стабилизированную амплификацию генов ацетил-CoA-карбоксилазы для облегчения биосинтеза актинородина в Streptomyces coelicolor .Кроме того, с помощью этого инструментария мы достигли увеличения на 185,6% титров 5-оксомилбемицина (с 2,23 до 6,37 г / л) в Streptomyces hygroscopicus за счет мультилокусной интеграции всего 5-оксомилбемицина BGC (72kb) (вверх до четырех экземпляров). По сравнению с ранее описанными методами, метод усовершенствованной мультиплексной сайт-специфической геномной инженерии (aMSGE) не требует внесения каких-либо модификаций в геномы хозяина перед амплификацией целевых генов или BGC, что значительно упростит и ускорит усилия по улучшению продукции NP. Учитывая, что системы SSR широко распространены среди множества промышленных микробов, этот новый метод также обещает стать ценным инструментом для улучшенного биосинтеза других ценных биопродуктов.

Ключевые слова

Сайт-специфическая рекомбинация

Интеграция с множеством копий

Актиномицеты

Натуральный продукт

Кластер биосинтетических генов (BGC)

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)

Полный текст

© 2018 International Metabolic Engineering Society.Опубликовано Elsevier Inc. Все права защищены.

Рекомендуемые статьи

Ссылки на статьи

Мультиплекс назначен для нового центра обработки данных Landmark Sydney | Новости

НОВЫЙ ЮЖНЫЙ УЭЛЬС, АВСТРАЛИЯ: NEXTDC поручил ведущей строительной компании Multiplex поставить первую очередь центра обработки данных S3, расположенного в Артармоне на нижнем северном берегу Сиднея.

Это назначение последовало за успешной поставкой Multiplex высотных гипермасштабируемых центров обработки данных нового поколения NEXTDC; включая P2 Perth, объект мощностью 20 МВт в центральном деловом районе Перта, и высококачественное завершение S2 Sydney, объекта мощностью 30 МВт в Macquarie Park, который был полностью завершен в июле 2020 года.

Новый центр обработки данных S3 NEXTDC, расположенный по адресу 2 Broadcast Way, будет иметь общую площадь около 34 000 квадратных метров на восьми этажах и обеспечит более 20 000 квадратных метров ИТ-пространства. Это будет включать около 26 770 квадратных метров залов обработки данных и вспомогательной инфраструктуры.

Разработанный архитекторами Greenbox, проект также будет включать ряд удобств для арендаторов, включая удобные рабочие места, зоны для совместной работы, автостоянку и более 4000 квадратных метров критически важных офисных помещений.

S3 Sydney является третьим и крупнейшим центром обработки данных NEXTDC в Сиднее и будет напрямую подключаться к существующим центрам обработки данных S1 и S2 Sydney.

«Мы очень рады быть привлеченными к этому инновационному проекту и продолжаем наше постоянное сотрудничество с NEXTDC. «Мы рады использовать наш опыт в строительстве новаторских высотных центров обработки данных и помочь NEXTDC расширить операции центров обработки данных мирового класса по всей Австралии», — сказал Дэвид Ганноум, региональный управляющий директор Multiplex в Новом Южном Уэльсе.

Строительство началось, объект будет полностью введен в эксплуатацию в 3 полугодии 22 финансового года

Обладая тем же рейтингом 5 звезд по энергоэффективности, что и существующие объекты NEXTDC, S3 будет спроектирован и построен в соответствии со стандартами Uptime Tier IV. Сертификация Tier IV признает полную отказоустойчивость объекта и подчеркивает образцовые уровни надежности и отказоустойчивости, обеспечивая максимальное резервирование для питания и охлаждения.

NEXTDC — лидер рынка с точки зрения своих передовых методов устойчивого развития; Таким образом, S3 будет отстаивать ряд функций ESD, включая систему охлаждения с пониженным энергопотреблением.Хотя охлаждение внутри здания жизненно важно для его работы, на предприятии будет реализовано «естественное охлаждение» для дальнейшего снижения энергопотребления и оптимизации уровней эффективности.

Интересно, что конструкция представляет собой преимущественно «гибридную» схему, в которой используется комбинация армированного бетона и бетона, подвергнутого последующему напряжению, и конструкционной стали для боковой поддержки из-за ее более высокой грузоподъемности при работе с тяжелыми установками и оборудованием.

В июле 2020 года Multiplex завершил строительство высотного центра обработки данных P2 Perth (этап 1) NEXTDC, в результате чего объект был построен вовремя и в рекордные сроки — 18 месяцев.Предоставляя шесть уровней залов обработки данных и два уровня электрической инфраструктуры, P2 обеспечивает 10 000 квадратных метров технических площадей и 20 мегаватт электроэнергии для экономики Западной Австралии.

STEM для всех мультиплексоров

Часто задаваемые вопросы для посетителей В мультиплексе более 1000 видеороликов. Как мне найти интересующие меня видео и проекты? Как я могу использовать сайт Multiplex для поиска интересующих меня видео, если я…? Как я могу создать плейлист? Как я могу сохранить список моих любимых видео? Где я могу найти свои сохраненные плейлисты и избранное? Как я могу поделиться плейлистом, созданным мной, с моими коллегами? Какая тема месяца? Есть ли уже созданные плейлисты, которые я могу просматривать? Как я могу выступить на мероприятии STEM for All Video Showcase? Как я могу оставаться в курсе событий и мероприятий STEM for All Video Showcase и Multiplex? Доступны ли субтитры для видео? С кем мне связаться, если у меня возникнут дополнительные вопросы или возникнут технические проблемы? Почему в одних презентациях есть карта действий, а в других нет? Что такое сайт Multiplex? Что я могу делать на этом сайте? Кто может стать участником этого сайта?

Учитель или администратор школы?

Поиск видео по интересующей тематике.Используйте фильтр «Аудитория» для просмотра видео, предназначенных для преподавателей / администраторов. Используйте фильтры по ключевым словам и / или классам, чтобы сузить тематику и возрастную группу учащихся, представляющих интерес. Используйте поле поиска, чтобы ввести любой интересующий термин или имя.

Исследователь заинтересован в поиске проектов, представляющих интерес в образовании STEM и CS?

Используйте фильтр Аудитория, чтобы найти видео, предназначенные для исследовательской аудитории. Используйте фильтры по ключевым словам и / или классам, чтобы сузить темы и возрастную группу учащихся, представляющих наибольший интерес.Используйте поле поиска, чтобы ввести любой интересующий термин или имя.

Ищете проекты в определенном штате? Или от конкретной организации?

Используйте фильтр состояния, чтобы найти видео по проекту в определенном состоянии. Чтобы упростить поиск видео по проектам и докладчикам из определенной организации, введите название организации в поле поиска. Также можно использовать фильтр организации.

Хотите получить финансирование от конкретной программы Национального научного фонда или другой федеральной программы?

Для поиска интересующих программ NSF используйте фильтр «Программа NSF», чтобы найти видеоролики о проектах, которые были профинансированы этими программами.Используйте фильтр спонсора, чтобы найти проекты, финансируемые федеральными агентствами, кроме NSF (NASA, NIH и т. Д.).

Ищете видео о STEM и высшем образовании?

Используйте фильтр Аудитория, чтобы найти видео, предназначенные для преподавателей или администраторов с высшим образованием. Используйте фильтры по ключевым словам и / или классам, чтобы сузить темы и возрастную группу учащихся, представляющих наибольший интерес. Используйте фильтр Программы NSF, чтобы выбрать программы, ориентированные на получение высшего и последипломного образования (например,грамм. IUSE, LSAMP, HBCU-UP, IGERT и др.). Используйте поле поиска, чтобы ввести любой интересующий термин или имя.

Ищете видео о неформальном изучении STEM ing?

Используйте фильтр Аудитория, чтобы найти видео, предназначенные для неформальных преподавателей. Используйте фильтры по ключевым словам и / или классам, чтобы сузить темы и возрастную группу учащихся, представляющих наибольший интерес. Используйте фильтр программы NSF, чтобы выбрать проекты, финансируемые программой AISL (продвижение неформального обучения STEM). Используйте поле поиска, чтобы ввести любой интересующий термин или имя.

Multiplex сайт будет закрыт после подтвержденных случаев COVID-19

Было зарегистрировано 12 подтвержденных случаев коронавируса на сайте Multiplex Premier Apartments по адресу 134-160 Spencer Street, Мельбурн (далее — сайт Бейонсе) и до 20 случаев близкого или случайного контактные работники определены.

В соответствии с «Процессом подтвержденных случаев COVID-19» в соответствии с рекомендациями, предоставленными Главным санитарным директором и DHHS, строительная компания Multiplex была уведомлена о подтвержденных случаях вместе с CFMEU, PPTEU, ETU и AMWU. .Участок был немедленно закрыт для полной очистки на уровне больниц.

Все работники, идентифицированные как находящиеся в тесном и случайном контакте с подтвержденными случаями, были немедленно отправлены домой и получили приказ пройти тестирование и самоизолироваться, пока они не получат результаты своих тестов.

Несмотря на то, что усиление мер безопасности на объектах было положительным, из-за увеличения передачи вирусов в сообществах руководство Multiplex и коллективные союзы согласились на полное закрытие объекта.Эта мера была принята для обеспечения безопасности всех строителей и руководства Multiplex на стройплощадке.

Все рабочие на этом объекте были уведомлены о закрытии, и тестовый автобус Incolink и медицинская бригада были на месте, чтобы предложить тесты для всех рабочих, у которых не было симптомов, в качестве дополнительной меры безопасности.

CFMEU был чрезвычайно активен в управлении и обеспечении мер COVID-19, делая все возможное, чтобы члены были информированы и соблюдали все правильные правила в отношении COVID-19.

Здоровье и безопасность наших членов являются высшим приоритетом, и мы решительно осуждаем любое поведение, которое не соответствует надлежащим мерам, принятым для защиты наших работников и общества в целом.

Мы умоляем всех членов и строительных рабочих продолжать следовать всем мерам и руководящим принципам, принятым для их безопасности, включая строгие правила гигиены, социальное дистанцирование, ношение масок и разделение рабочих на перерывы на обед, как это предусмотрено Управлением премьер-министра и DHHS .

/ Публичный выпуск. Этот материал поступает от исходной организации и может иметь определенный момент времени, отредактированный для ясности, стиля и длины.

Multiplex немедленно закрывает строительные площадки | Новости

Multiplex стал первым крупным подрядчиком, который добровольно закрыл объекты после того, как премьер-министр вчера вечером ввел в Великобританию трехнедельную изоляцию от коронавируса.

Фирма работает над рядом высококлассных работ в Лондоне, включая строительство 22-й башни Бишопсгейт, которая близка к завершению, двухэтажную схему One Nine Elms и схему роскошных квартир под названием Broadway по соседству со станцией St James’s Park .

В электронном письме, которое увидел Building, которое было отправлено 900 сотрудникам фирмы поздно вечером, главный операционный директор фирмы Каллум Такетт сказал: «В ответ на публичное выступление премьер-министра сегодня вечером у нас нет разумного выбора, кроме как закрыть все строительные площадки немедленно и до дальнейшего уведомления.

«Строительство не может быть определено как« абсолютно необходимое », мы ищем разъяснения по этому поводу, но мы считаем, что лучшим и наиболее подходящим действием является закрытие наших сайтов.”

Tuckett сказал, что фирма, которая также работает над схемой торговых центров Elephant & Castle, приняла решение, потому что сайты больше не могли придерживаться правительственных директив, направленных на борьбу с вирусом.

Он добавил: «Мы приняли нелегкое решение. На каждом этапе этого глобального кризиса мы тщательно взвешивали и соблюдали все выпущенные правительственные и медицинские рекомендации.

«Мы осознаем, что значительная часть работников, работающих на наших объектах, работает не по найму и полагается на открытость участка для получения средств к существованию.Таким образом, в соответствии с указаниями правительства мы стремились поддерживать сайты открытыми, в то же время применяя строгие меры для обеспечения безопасного проведения операций, в том числе путем внедрения протоколов социального дистанцирования и очистки в соответствии с передовой государственной практикой.

«Последние указания правительства ясны, развертывания таких мер безопасности уже недостаточно. Все ненужные выезды за пределы дома необходимо прекратить. Хотя строительная отрасль, несомненно, играет важную роль в качестве ключевого фактора экономики Великобритании, мы признаем, что не так важно, чтобы мы могли подвергнуть наших заинтересованных сторон и более широкое сообщество риску физического вреда.

«Мы также признаем первостепенное обязательство, которое теперь разделяют все предприятия, чтобы избежать дополнительной нагрузки на NHS, которая делает все возможное, чтобы остановить распространение вируса и которая нуждается в нашей полной поддержке».

Вчера вечером отрасль оказалась в подвешенном состоянии после того, как министр кабинета министров заявил, что сайты могут оставаться открытыми — менее чем через 90 минут после того, как премьер-министр ввел запрет на работу в Великобритании.

Набор инструментов CRISPR / Cas9 для редактирования мультиплексного генома растений | BMC Plant Biology

1.

Крысан П.Дж., Янг Дж.С., Суссман М.Р.: Т-ДНК как инсерционный мутаген у арабидопсиса. Растительная клетка. 1999, 11: 2283-2290. 10.1105 / tpc.11.12.2283.

PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

2.

Jeon JS, Lee S, Jung KH, Jun SH, Jeong DH, Lee J, Kim C, Jang S, Yang K, Nam J, An K, Han MJ, Sung RJ, Choi HS, Yu JH , Choi JH, Cho SY, Cha SS, Kim SI, An G: инсерционный мутагенез T-ДНК для функциональной геномики риса.Плант Дж. 2000, 22: 561-570. 10.1046 / j.1365-313x.2000.00767.x.

Артикул CAS PubMed Google Scholar

3.

Gaj T, Gersbach CA, Barbas CF: ZFN, TALEN и основанные на CRISPR / Cas методы для геномной инженерии. Trends Biotechnol. 2013, 31: 397-405. 10.1016 / j.tibtech.2013.04.004.

PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

4.

Pennisi E: помешательство на CRISPR. Наука. 2013, 341: 833-836. 10.1126 / science.341.6148.833.

Артикул CAS PubMed Google Scholar

5.

Сигал Д.Д.: Бактерии знаменуют собой новую эру редактирования генов. Элиф. 2013, 2: e00563-10.7554 / eLife.00563.

PubMed Central Статья PubMed Google Scholar

6.

Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval P, Moineau S, Romero DA, Horvath P: CRISPR обеспечивает приобретенную устойчивость к вирусам у прокариот.Наука. 2007, 315: 1709-1712. 10.1126 / science.1138140.

Артикул CAS PubMed Google Scholar

7.

Хорват П., Баррангу Р: CRISPR / Cas, иммунная система бактерий и архей. Наука. 2010, 327: 167-170. 10.1126 / science.1179555.

Артикул CAS PubMed Google Scholar

8.

Jinek M, Chylinski K, Fonfara I., Hauer M, Doudna JA, Charpentier E: Программируемая эндонуклеаза ДНК, управляемая двойной РНК, в адаптивном бактериальном иммунитете.Наука. 2012, 337: 816-821. 10.1126 / science.1225829.

Артикул CAS PubMed Google Scholar

9.

Jinek M, Jiang F, Taylor DW, Sternberg SH, Kaya E, Ma E, Anders C, Hauer M, Zhou K, Lin S, Kaplan M, Iavarone AT, Charpentier E, Nogales E, Doudna JA : Структуры эндонуклеаз Cas9 обнаруживают РНК-опосредованную конформационную активацию. Наука. 2014, 343: 1247997-10.1126 / science.1247997.

PubMed Central Статья PubMed Google Scholar

10.

Nishimasu H, Ran FA, Hsu PD, Konermann S, Shehata SI, Dohmae N, Ishitani R, Zhang F, Nureki O: Кристаллическая структура Cas9 в комплексе с направляющей РНК и целевой ДНК. Клетка. 2014, 156: 935-949. 10.1016 / j.cell.2014. 02.001.

PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

11.

Sternberg SH, Redding S, Jinek M, Greene EC, Doudna JA: исследование ДНК эндонуклеазой Cas9, управляемой CRISPR РНК. Природа. 2014, 507: 62-67.10.1038 / природа13011.

PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

12.

Чо С.В., Ким С., Ким Дж. М., Ким Дж. С.: Нацеленная геномная инженерия в человеческих клетках с помощью РНК-управляемой эндонуклеазы Cas9. Nat Biotechnol. 2013, 31: 230-232. 10.1038 / nbt.2507.

Артикул CAS PubMed Google Scholar

13.

Конг Л., Ран Ф.А., Кокс Д., Лин С., Барретто Р., Хабиб Н., Хсу П. Д., Ву Х, Цзян В., Марраффини Л. А., Чжан Ф .: Мультиплексная геномная инженерия с использованием систем CRISPR / Cas.Наука. 2013, 339: 819-823. 10.1126 / science.1231143.

PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

14.

ДиКарло Дж. Э., Норвилл Дж. Э., Мали П., Риос Х, Аах Дж., Черч Дж. М.: Геномная инженерия в Saccharomyces cerevisiae с использованием систем CRISPR-Cas. Nucleic Acids Res. 2013, 41: 4336-4343. 10.1093 / нар / gkt135.

PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

15.

Фэн З., Чжан Б., Дин В., Лю X, Ян Д.Л., Вей П., Цао Ф, Чжу С., Чжан Ф., Мао Ю., Чжу Дж. К.: Эффективное редактирование генома растений с использованием системы CRISPR / Cas. Cell Res. 2013, 23: 1229-1232. 10.1038 / cr.2013.114.

PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

16.

Фридланд А.Е., Цур Ю.Б., Эсвельт К.М., Колаяково М.П., ​​Чёрч Г.М., Каларко Дж.А.: Наследственное редактирование генома C. elegans с помощью системы CRISPR-Cas9. Нат методы.2013, 10: 741-743. 10.1038 / nmeth.2532.

PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

17.

Hsu PD, Scott DA, Weinstein JA, Ran FA, Konermann S, Agarwala V, Li Y, Fine EJ, Wu X, Shalem O, Cradick TJ, Marraffini LA, Bao G, Zhang F: нацеливание на ДНК специфичность РНК-управляемых нуклеаз Cas9. Nat Biotechnol. 2013, 31: 827-832. 10.1038 / nbt.2647.

PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

18.

Хван В.Й., Фу Й., Рейон Д., Мейдер М.Л., Цай С.К., Сандер Д.Д., Петерсон Р.Т., Йе Дж.Р., Джунг Дж.К .: Эффективное редактирование генома рыбок данио с использованием системы CRISPR-Cas. Nat Biotechnol. 2013, 31: 227-229. 10.1038 / nbt.2501.

PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

19.

Цзян В., Чжоу Х., Би Х., Фромм М., Ян Б., Weeks DP: демонстрация опосредованной CRISPR / Cas9 / sgRNA целевой модификации генов в арабидопсисе, табаке, сорго и рисе.Nucleic Acids Res. 2013, 41: e188-10.1093 / nar / gkt780.

PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

20.

Li JF, Norville JE, Aach J, McCormack M, Zhang D, Bush J, Church GM, Sheen J: Мультиплексное и опосредованное гомологичной рекомбинацией редактирование генома арабидопсиса и nicotiana benthamiana с использованием направляющей РНК и Cas9. Nat Biotechnol. 2013, 31: 688-691. 10.1038 / nbt.2654.

PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

21.

Мали П., Ян Л., Эсвелт К.М., Аах Дж., Гуэль М., ДиКарло Дж. Э., Норвилл Дж. Э., Черч Г. М.: РНК-управляемая инженерия генома человека с помощью Cas9. Наука. 2013, 339: 823-826. 10.1126 / science.1232033.

PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

22.

Мао Ю., Чжан Х., Сюй Н., Чжан Б., Гао Ф., Чжу Дж.К .: Применение системы CRISPR-Cas для эффективной геномной инженерии растений. Завод Мол. 2013, 6: 2008-2011. 10.1093 / mp / sst121.

PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

23.

Некрасов В., Стаскавич Б., Вейгель Д., Джонс Дж. Д., Камун С.: Целевой мутагенез в модельном растении nicotiana benthamiana с использованием эндонуклеазы, управляемой РНК Cas9. Nat Biotechnol. 2013, 31: 691-693. 10.1038 / nbt.2655.

Артикул CAS PubMed Google Scholar

24.

Shan Q, Wang Y, Li J, Zhang Y, Chen K, Liang Z, Zhang K, Liu J, Xi JJ, Qiu JL, Gao C: целевая модификация генома сельскохозяйственных культур с использованием CRISPR-Cas система.Nat Biotechnol. 2013, 31: 686-688. 10.1038 / nbt.2650.

Артикул CAS PubMed Google Scholar

25.

Шен Б., Чжан Дж., Ву Х, Ван Дж., Ма К., Ли З, Чжан Х, Чжан П., Хуанг Х: создание генно-модифицированных мышей посредством нацеливания на гены, опосредованного Cas9 / РНК. Cell Res. 2013, 23: 720-723. 10.1038 / cr.2013.46.

PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

26.

Xie K, Yang Y: РНК-управляемое редактирование генома растений с использованием системы CRISPR-Cas. Завод Мол. 2013, 6: 1975-1983. 10.1093 / mp / sst119.

Артикул CAS PubMed Google Scholar

27.

Ян Х., Ван Х., Шивалила С.С., Ченг А.В., Ши Л., Яениш Р.: Одношаговое поколение мышей, несущих репортерные и условные аллели, с помощью CRISPR / Cas-опосредованной геномной инженерии. Клетка. 2013, 154: 1370-1379. 10.1016 / j.cell.2013.08.022.

PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

28.

Li D, Qiu Z, Shao Y, Chen Y, Guan Y, Liu M, Li Y, Gao N, Wang L, Lu X, Zhao Y, Liu M: наследственное нацеливание на гены у мышей и крыс с использованием CRISPR-Cas система. Nat Biotechnol. 2013, 31: 681-683. 10.1038 / nbt.2661.

Артикул CAS PubMed Google Scholar

29.

Li W, Teng F, Li T, Zhou Q: Одновременное генерирование и передача нескольких генных мутаций в зародышевой линии у крыс с использованием систем CRISPR-Cas. Nat Biotechnol.2013, 31: 684-686. 10.1038 / nbt.2652.

Артикул CAS PubMed Google Scholar

30.

Ван Х., Ян Х., Шивалила С.С., Давлати М.М., Ченг А.В., Чжан Ф., Яениш Р.: Одношаговое поколение мышей, несущих мутации во множестве генов, с помощью CRISPR / Cas-опосредованной геномной инженерии. Клетка. 2013, 153: 910-918. 10.1016 / j.cell.2013.04.025.

PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

31.

Jao LE, Wente SR, Chen W.: Эффективное мультиплексное двуаллельное редактирование генома рыбок данио с использованием системы нуклеаз CRISPR. Proc Natl Acad Sci USA. 2013, 110: 13904-13909. 10.1073 / pnas.1308335110.

PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

32.

Niu Y, Shen B, Cui Y, Chen Y, Wang J, Wang L, Kang Y, Zhao X, Si W, Li W, Xiang AP, Zhou J, Guo X, Bi Y, Si C , Hu B, Dong G, Wang H, Zhou Z, Li T, Tan T, Pu X, Wang F, Ji S, Zhou Q, Huang X, Ji W, Sha J: Создание генно-модифицированной яванской обезьяны через Cas9 / РНК-опосредованное нацеливание на гены в одноклеточных эмбрионах.Клетка. 2014, 156: 836-843. 10.1016 / j.cell.2014.01.027.

Артикул CAS PubMed Google Scholar

33.

Мяо Дж., Го Д., Чжан Дж., Хуанг К., Цинь Г, Чжан Х, Ван Дж, Гу Х, Цюй Л. Дж . : Целевой мутагенез риса с использованием системы CRISPR-Cas. Cell Res. 2013, 23: 1233-1236. 10.1038 / cr.2013.123.

PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

34.

Белхадж К., Чапарро-Гарсия А., Камун С., Некрасов В.: Редактирование генома растений стало проще: целевой мутагенез в модельных и сельскохозяйственных культурах с использованием системы CRISPR / Cas. Растительные методы. 2013, 9: 39-10.1186 / 1746-4811-9-39.

PubMed Central Статья PubMed Google Scholar

35.

Fauser F, Schiml S, Puchta H: И нуклеазы на основе CRISPR / Cas, и никазы могут быть эффективно использованы для геномной инженерии Arabidopsis thaliana.Плант Дж. 2014, 79: 348-359. 10.1111 / tpj.12554.

Артикул CAS PubMed Google Scholar

36.

Feng Z, Mao Y, Xu N, Zhang B, Wei P, Yang DL, Wang Z, Zhang Z, Zheng R, Yang L, Zeng L, Liu X, Zhu JK: анализ нескольких поколений показывает наследование , специфичность и паттерны модификаций генов, индуцированных CRISPR / Cas у Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA. 2014, 111: 4632-4637. 10.1073 / pnas.1400822111.

PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

37.

Jia H, Wang N: Целевое редактирование генома сладкого апельсина с использованием Cas9 / sgRNA. PLoS One. 2014, 9: e93806-10.1371 / journal.pone.0093806.

PubMed Central Статья PubMed Google Scholar

38.

Цзян В., Ян Б., Weeks DP: Эффективное CRISPR / Cas9-опосредованное редактирование генов в Arabidopsis thaliana и наследование модифицированных генов в поколениях T2 и T3. PLoS One. 2014, 9: e99225-10.1371 / journal.pone.0099225.

PubMed Central Статья PubMed Google Scholar

39.

Xie K, Zhang J, Yang Y: Геномное предсказание высокоспецифичных спейсеров направляющей РНК для CRISPR-Cas9-опосредованного редактирования генома в модельных растениях и основных сельскохозяйственных культурах. Завод Мол. 2014, 7: 923-926. 10.1093 / mp / ssu009.

Артикул CAS PubMed Google Scholar

40.

Zhang H, Zhang J, Wei P, Zhang B, Gou F, Feng Z, Mao Y, Yang L, Zhang H, Xu N, Zhu JK: Система CRISPR / Cas9 производит специфический и гомозиготный целевой ген редактирование риса за одно поколение.Plant Biotechnol J. 2014, 12: 797-807. 10.1111 / pbi.12200.

Артикул CAS PubMed Google Scholar

41.

Hellens RP, Edwards EA, Leyland NR, Bean S, Mullineaux PM: pGreen: универсальный и гибкий бинарный Ti-вектор для опосредованной агробактериями трансформации растений. Завод Мол Биол. 2000, 42: 819-832. 10.1023 / А: 1006496308160.

Артикул CAS PubMed Google Scholar

42.

Curtis MD, Grossniklaus U: Набор векторных клонирующих векторов для высокопроизводительного функционального анализа генов плантаций. Plant Physiol. 2003, 133: 462-469. 10.1104 / pp.103.027979.

PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

43.

Ли Л.Ю., Гельвин С.Б.: бинарные векторы и системы Т-ДНК. Plant Physiol. 2008, 146: 325-332. 10.1104 / pp.107.113001.

PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

44.

Weber E, Engler C, Gruetzner R, Werner S, Marillonnet S: модульная система клонирования для стандартизированной сборки мультигенных конструкций. PLoS One. 2011, 6: e16765-10.1371 / journal.pone.0016765.

PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

45.

Энглер С., Кандзиа Р., Мариллоннет С. Метод точного клонирования в один горшок, в один этап и с высокой производительностью. PLoS One. 2008, 3: e3647-10.1371 / journal.pone.0003647.

PubMed Central Статья PubMed Google Scholar

46.

Гибсон Д.Г., Янг Л., Чуанг Р.Й., Вентер Дж. К., Хатчисон, Калифорния, Смит Х.О .: Ферментативная сборка молекул ДНК размером до нескольких сотен килобаз. Нат методы. 2009, 6: 343-345. 10.1038 / nmeth.1318.

Артикул CAS PubMed Google Scholar

47.

Кирик В., Саймон М., Вестер К., Шифельбейн Дж., Хульскэмп М.: ENHANCER of TRY и CPC 2 (ETC2) обнаруживает избыточность в региональном контроле развития трихом арабидопсиса.Завод Мол Биол. 2004, 55: 389-398. 10.1007 / s11103-004-0893-8.

Артикул CAS PubMed Google Scholar

48.

Huang YS, Li HM: Arabidopsis CHLI2 может заменять CHLI1. Plant Physiol. 2009, 150: 636-645. 10.1104 / pp.109.135368.

PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

49.

Hajdukiewicz P, Svab Z, Maliga P: Небольшое, универсальное семейство pPZP бинарных векторов agrobacterium для трансформации растений.Завод Мол Биол. 1994, 25: 989-994. 10.1007 / BF00014672.

Артикул CAS PubMed Google Scholar

50.

Zhang Y, Su J, Duan S, Ao Y, Dai J, Liu J, Wang P, Li Y, Liu B, Feng D, Wang J, Wang H: высокоэффективная протопластная система рисовой зеленой ткани. для временной экспрессии генов и изучения процессов, связанных со светом / хлоропластами. Растительные методы. 2011 г., 7: 30-10.1186 / 1746-4811-7-30.

PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

Повышение возможностей мультиплексного редактирования CRISPR / Cas9 с помощью системы обработки эндогенной тРНК

Значимость

Кластеризованная система коротких палиндромных повторов (CRISPR) / CRISPR-ассоциированная нуклеаза белка 9 (Cas9) с регулярными интервалами недавно стала эффективной и универсальный инструмент для редактирования генома различных организмов. Однако его возможности нацеливания и эффективность мультиплексного редактирования часто ограничиваются устройством, экспрессирующим направляющую РНК (гРНК). Это исследование демонстрирует общую стратегию и платформу для точной обработки и эффективного производства многочисленных гРНК in vivo из синтетического полицистронного гена через систему обработки эндогенной тРНК. Показано, что эта стратегия значительно увеличивает возможности мультиплексного редактирования CRISPR / Cas9 и эффективность у растений и, как ожидается, найдет широкое применение для экспрессии малых РНК и геномной инженерии.

Abstract

Кластерная система коротких палиндромных повторов с регулярными интервалами (CRISPR) / CRISPR-ассоциированная нуклеаза белка 9 (Cas9) используется в качестве мощного инструмента для геномной инженерии в фундаментальных исследованиях, молекулярной терапии и улучшении сельскохозяйственных культур. Эта система использует небольшую направляющую РНК (gRNA) для направления эндонуклеазы Cas9 к определенному участку ДНК; таким образом, его способность к нацеливанию в значительной степени ограничивается устройством, экспрессирующим гРНК. В этом исследовании мы разработали общую стратегию получения множества гРНК из одного полицистронного гена.Система обработки эндогенной тРНК, которая точно расщепляет оба конца предшественника тРНК, была спроектирована как простая и надежная платформа для повышения возможностей нацеливания и мультиплексного редактирования системы CRISPR / Cas9. Мы продемонстрировали, что синтетические гены с тандемно выстроенной архитектурой тРНК-гРНК эффективно и точно преобразовывались в гРНК с желательными 5′-целевыми последовательностями in vivo, что заставляло Cas9 редактировать несколько хромосомных мишеней. Используя эту стратегию, мультиплексное редактирование генома и делеция хромосомных фрагментов были легко достигнуты в стабильных трансгенных растениях риса с высокой эффективностью (до 100%).Поскольку тРНК и ее система обработки практически сохраняются во всех живых организмах, этот метод можно широко использовать для повышения способности нацеливания и эффективности редактирования наборов инструментов CRISPR / Cas9.

Высшие организмы часто используют сложные генетические сети с функционально избыточными генами для тонкой настройки клеточных процессов. Следовательно, молекулярные инструменты, позволяющие одновременно манипулировать несколькими генами, имеют большую ценность как в фундаментальных исследованиях, так и в практических приложениях генной инженерии.В последнее время многообещающим инструментом для этой цели становится бактериальная система типа II с регулярным расположением коротких палиндромных повторов (CRISPR) и CRISPR-ассоциированная (Cas) белковая система. Эндонуклеаза Cas9 из Streptococcus pyogenes , связанная с искусственной направляющей РНК (гРНК), способна нацеливаться на последовательность ДНК 5′-N20-NGG-3 ‘(N означает любое основание), в которой N20 совпадает с 20 оснований 5’-последовательности гРНК (далее именуемой спейсером гРНК), а NGG представляет собой мотив, примыкающий к протоспейсер (PAM) (1-3).Простое программируемое правило, управляемое РНК, и высокая встречаемость PAM в геномах позволили Cas9-gRNA легко нацеливаться почти на все генетические элементы для редактирования генома. Благодаря своей простоте и высокой эффективности инструменты на основе Cas9 были быстро разработаны для редактирования генома / эпигенома, регуляции транскрипции и других приложений в генной инженерии (4-6).

В принципе, мультиплексное редактирование генома может быть достигнуто путем экспрессии Cas9 (или эффекторов, производных Cas9) вместе с множественными гРНК для соответствующих сайтов-мишеней.Обычные методы доставки включают либо микроинъекцию, либо экспрессию генных конструкций, содержащих множественные кассеты, экспрессирующие одиночную гРНК (sgRNA), для мультиплексного редактирования генома (2, 3, 7–11). Прямая микроинъекция синтезированных in vitro гРНК и белка Cas9 (или мРНК Cas9) в клетку или эмбрион подходит только для очень небольшого числа систем. В результате наиболее распространенной стратегией является укладывание нескольких кассет, экспрессирующих sgRNA, в одну плазмидную конструкцию или использование нескольких конструкций. Типичный размер одной кассеты, экспрессирующей sgRNA, составляет около 400-500 п.н. и состоит из промотора РНК-полимеразы III (Pol III), гРНК и терминатора Pol III.Из-за ограничений способа доставки и емкости плазмидного вектора одновременное продуцирование множества gRNA было бы проблемой с такой стратегией экспрессии gRNA для большинства организмов. Более того, эукариотическая РНК, транскрибируемая Pol III, обязана начинаться со специфического рибонуклеотида, который может снижать целевые сайты Cas9 / gRNA. Продвинутая стратегия может заключаться в уплотнении нескольких gRNA в одном синтетическом гене и разработке системы обработки РНК для вырезания отдельных gRNA из первичного транскрипта.Единственным проверенным методом, основанным на такой стратегии, является экспрессия эндорибонуклеазы Csy4 (эндо-РНКаза) с помощью Cas9 для обработки транскрипта, содержащего gRNAs, слитые с Csy4-расщепляемой РНК (12, 13). Тем не менее, необходимы более надежные и точные методы для одновременного производства нескольких гРНК, чтобы улучшить возможности мультиплексного редактирования и облегчить более сложные приложения Cas9.

РНК является фундаментальным клеточным компонентом, и ее производство гарантируется консервативными и точными системами обработки РНК в различных организмах.Это понятие вдохновило нас на создание системы обработки эндогенной РНК для производства нескольких гРНК из одного транскрипта, вместо того, чтобы вводить какие-либо дополнительные РНКазы вместе с компонентами Cas9 / gRNA. В этом исследовании мы продемонстрировали, что несколько гРНК могут быть эффективно продуцированы из одного синтетического гена с архитектурой тРНК-гРНК после точного вырезания транскриптов in vivo эндогенными РНКазами. Было показано, что эта стратегия экспрессии гРНК не только позволяет осуществлять мультиплексное нацеливание, но также повышает эффективность редактирования системы CRISPR / Cas9 в растениях.Поскольку система обработки тРНК существует практически во всех организмах, эту стратегию можно широко использовать для повышения возможностей мультиплексного редактирования инструментов CRISPR / Cas9 для геномной инженерии.

Результаты

Стратегия разработки системы обработки тРНК для получения множества гРНК.

Для одновременного получения нескольких гРНК из одного первичного транскрипта мы стремились уплотнить кластер гРНК с разными спейсерами в одном полицистронном гене и захватить систему обработки эндогенной РНК для расщепления этого транскрипта на отдельные гРНК в ядре.В поисках РНК и эндо-РНКаз, потенциально отвечающих этому требованию, тРНК привлекла наше внимание своими характеристиками следующим образом. ( i ) В нуклеоплазме предшественники тРНК (пре-тРНК) расщепляются в определенных сайтах у эукариот РНКазой P и РНКазой Z (или РНКазой E в бактериях) для удаления 5 ‘и 3’ лишних последовательностей (рис. 1 A ) соответственно (14⇓⇓⇓ – 18). ( ii ) РНКаза P и РНКаза Z распознают структуру тРНК, независимо от последовательности пре-тРНК (17, 18). Предыдущие исследования показали, что только акцепторный стержень, плечо D-петли и плечо TψC-петли тРНК необходимы для расщепления пре-тРНК РНКазой P и РНКазой Z (16⇓⇓-19).( iii ) тРНК была обнаружена в полицистронной транскрипционной единице у бактерий (20) и иногда у эукариот (19, 21), что позволяет предположить, что система процессинга тРНК, вероятно, используется как внутренний механизм для производства различных малых РНК [например, малая ядрышковая РНК (мяРНК)] с тРНК из одного полицистронного гена (19). ( iv ) Поскольку тРНК является одним из наиболее распространенных клеточных компонентов, эндогенная система обработки тРНК должна быть устойчивой для обработки большого количества субстратов.( v ) Гены тРНК содержат внутренние промоторные элементы (блоки A и B) для рекрутирования комплекса РНК-полимеразы III (Pol III) (рис. 1 B ) (22, 23). Следовательно, последовательность тРНК может также работать как потенциальный энхансер транскрипции для Pol III. Основываясь на этих особенностях, мы предположили, что эндогенная система тРНК может быть сконструирована как общая платформа для точного процессинга гРНК.

Рис. 1.

Разработка системы эндогенной тРНК для мультиплексного редактирования генома с помощью CRISPR / Cas9.( A ) Эукариотическая пре-тРНК с 5′-лидером и 3′-концом расщепляется РНКазой P и РНКазой Z в определенных сайтах. ( B ) Транскрипция гена тРНК с помощью РНК-полимеразы III (Pol III). Элементы бокса A и бокса B в гене тРНК функционируют как внутренние транскрипционные элементы и связаны с фактором транскрипции IIIC (TFIII C), который рекрутирует TFIIIB и Pol III для запуска транскрипции. ( C ) Схематическое изображение метода PTG / Cas9 для одновременного нацеливания на несколько сайтов.Синтетический PTG состоит из тандемно расположенных единиц тРНК-гРНК, при этом каждая гРНК содержит целевой спейсер (помечен ромбиком разного цвета) и консервативный каркас гРНК (прямоугольник). ТРНК, содержащая элементы бокса A и B, показана в виде круглых прямоугольников. Первичный транскрипт PTG расщепляется эндогенными РНКазой P и РНКазой Z (обозначенными как ножницы) с высвобождением зрелых гРНК и тРНК (красные линии структуры клеверного листа). Вырезанные зрелые гРНК направляют Cas9 к множеству мишеней.

Чтобы использовать систему эндогенной тРНК для редактирования мультиплексного генома с помощью Cas9 / gRNA, мы разработали ген полицистронной тРНК-гРНК ( PTG ) для одновременного производства множества гРНК. Как показано на фиг. 1 C , этот ген PTG состоит из тандемных повторов тРНК-гРНК и может транскрибироваться как нормальный ген snoRNA или sgRNA под контролем промотора Pol III. Эндогенные РНКазы, обрабатывающие тРНК (например, РНКаза P и РНКаза Z в растениях), будут распознавать компоненты тРНК и вырезать отдельные гРНК из транскрипта PTG .Полученные в результате gRNAs будут направлять Cas9 к нескольким сайтам-мишеням для редактирования генома (Fig. 1 C ).

Точная обработка

PTG для получения функциональных гРНК с желаемыми последовательностями нацеливания.

Чтобы выяснить, будет ли синтетический ген PTG транскрибироваться, обрабатываться и функционировать так, как мы предсказывали (рис. 1 C ), мы синтезировали четыре гена PTG со структурой тРНК-гРНК ( PTG1 и PTG2 ) или тРНК-гРНК-тРНК ( PTG1.1 и PTG2.1 ) (рис.2 A ). Эти четыре гена PTG были разработаны для продукции gRNA1 ( PTG1 и PTG1.1 ) и gRNA2 ( PTG2 и PTG2.1 ), которые были протестированы ранее (24) с генами sgRNA ( sgRNA1 и sgRNA2 ) в Cas9-опосредованном редактировании генома ( SI, приложение , рис. S1, A ; и см. Последовательность гена в SI, приложение , таблица S1). Обе гРНК нацелены на ген MPK5 риса, который кодирует митоген-активированную протеинкиназу (MAPK), участвующую в биотических и абиотических сигнальных путях.Эти PTG были сконструированы с геном пре-тРНК ^Gly длиной 77 п.н., который распознает кодон GGC и широко присутствует в различных геномах (25). Выбранная последовательность пре-тРНК ^Gly состоит из 5′-лидера (5′- AACAAA -3 ‘, 6 п.н.) и зрелой тРНК (71 п.н.) (фиг. 2 B ). Такое слияние тРНК-гРНК в PTGs имитирует нативный дицистрон тРНК-snoRNA43 у растений (19).

Рис. 2.

Точное удаление функциональных гРНК in vivo из синтетических генов PTG .( A ) Архитектура двух генов sgRNA и четырех PTG для получения одной гРНК. ( B ) Последовательность и предсказанная вторичная структура слияния тРНК-гРНК-тРНК гена PTG . Основания области тРНК показаны красным цветом, а 5′-лидер тРНК показан строчными буквами. GRNA обозначена черным цветом, а спейсерная последовательность gRNA показана как N. ( C — F ) Исследование зрелых gRNA, продуцированных из sgRNA или PTG s с помощью cRT-PCR. Суммарные РНК из протопластов, экспрессирующих пустой вектор, использовали в качестве контроля (СК). Стрелки указывают зрелые гРНК, амплифицированные с помощью cRT-PCR, а звездочки указывают неспецифически амплифицированную рРНК. ( G ) Сводка сайтов вырезания в PTG в соответствии с картированными концами гРНК из cRT-PCR ( SI, приложение , фиг. S3 – S5). Стрелки указывают сайты расщепления в PTG для высвобождения гРНК. 5′-концы зрелой гРНК вырезали из PTG точно в сайте слияния тРНК-гРНК во всех результатах кРТ-ПЦР, тогда как его 3′-концы смещались на 1–4 н. В 5′-лидере тРНК (нижний регистр).( H ) гРНК, продуцируемая из U3p: sgRNA . Все обнаруженные гРНК U3p: sgRNA, продуцируемая , начинались с рибонуклеотида A и заканчивались множеством Us. ( I ) Введение инделей в желаемые участки с помощью PTG1: Cas9 или PTG2: Cas9 в протопласты риса, как показано с помощью ПЦР / RE. Стрелки указывают на мутировавшие фрагменты, устойчивые к перевариванию RE. Частота отступа указана внизу. ( J ) Относительная экспрессия sgRNA1 / 2 и PTG1 / 2 в протопластах риса.Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. Н.Д., не обнаружено. СК, пустое векторное управление.

В этом исследовании мы использовали плазмидный вектор ( SI Приложение , рис. S2), в котором sgRNA или PTG экспрессируются с промотором snoRNA U3 риса ( U3p ), а Cas9 экспрессируется с помощью риса. промотор убиквитина плюс полная 5′-нетранслируемая область ( UBIp ). После трансфекции протопластов риса плазмидами, содержащими U3p: sgRNA или U3p: PTG , была проведена кольцевая ПЦР с обратной транскрипцией (cRT-PCR) (26, 27) для картирования как 5 ‘, так и 3’ концов зрелых гРНК (см. SI Приложение , рис.S3 и Таблица S2 для принципа cRT-PCR). Зрелые гРНК ожидаемого размера были обнаружены в протопластах, экспрессирующих PTG s или sgRNA s (фиг. 2 C — F ). Однако слитый транскрипт тРНК-гРНК из PTG s не обнаруживается с помощью cRT-PCR, вероятно, из-за очень надежной системы обработки тРНК, которая расщепляет большинство (если не все) первичных транскриптов PTGs . Анализ последовательности продуктов cRT-PCR показал, что все четыре транскрипта PTG были точно расщеплены на стыке тРНК-гРНК и продуцировали зрелые гРНК, несущие желаемые 5′-спейсерные последовательности без дополнительных нуклеотидов (рис.2 G и SI Приложение , рис. S4 и S5). С другой стороны, 3′-конец зрелых гРНК несет поли (U) хвост длиной от 1 до 7 нуклеотидов, если он предшествует терминатору Pol III ( sgRNA , PTG1 и PTG2 ) ( SI Приложение , Рис. S4), или рибонуклеотиды длиной от 1 до 4 нуклеотидов от тРНК-лидера, когда он предшествовал тРНК ( PTG1.1 и PTG2.1 ) ( SI Приложение , Рис. S5) . Данные cRT-PCR также подтвердили, что гРНК, транскрибируемые из U3p: sgRNA , должны были начинаться с нуклеотида A , тогда как U3p: PTG продуцировали гРНК без ограничения первого нуклеотида ( SI Приложение , рис.S4 и S5). Таким образом, gRNAs, продуцируемые из PTG , такие же, как sgRNAs, но не обязаны начинаться с определенного нуклеотида (рис. 2 G и H ).

Функциональность PTG1 и PTG2 была подтверждена путем исследования инсерционных / делеционных (инсерционных) мутаций, вызванных репарацией негомологичным концевым соединением (NHEJ) в предсказанном сайте расщепления Cas9: gRNA. Поскольку мишени gRNA1 и gRNA2 содержат сайты рестрикционных ферментов (RE) KpnI и SacI ( SI, приложение , рис.S1 A ), соответственно, мутации, индуцированные PTG1 / Cas9 и PTG2 / Cas9, могут быть легко проанализированы путем переваривания продуктов ПЦР, охватывающих целевые сайты, с соответствующим RE (анализ PCR / RE). В протопластах риса, трансфицированных PTG1 / Cas9 и PTG2 / Cas9 , было обнаружено, что 15% и 9% сайтов-мишеней несут индели соответственно (рис. 2 I ), что немного выше, чем частота мутаций. конструкций sgRNA: Cas9, которые мы использовали ранее (24).В соответствии с нашей гипотезой о том, что тРНК может функционировать как усилитель транскрипции для Pol III, количественная ОТ-ПЦР с праймерами, специфичными для гРНК, показала, что уровни транскриптов PTG1 и PTG2 были примерно в 3 и 31 раз выше, чем у sgRNA1 и sgRNA2 в протопластах (рис. 2 J ) соответственно. Взятые вместе, наши результаты продемонстрировали, что эндогенная система тРНК может быть использована в качестве точного и надежного инструмента для получения гРНК из PTG для Cas9-опосредованного редактирования генома.

Эффективное мультиплексное редактирование генома в протопластах риса с помощью PTG / Cas9.

Чтобы проверить способность нацеливания и эффективность системы PTG, до восьми gRNA (gRNA1 – gRNA8) ( SI Приложение , таблица S3 и рис. S1) были объединены в тандемную группу для создания PTG для нацеливания на четыре гомологичных MAPK риса ( MPK1 / 2/5/6 ), которые могут функционировать избыточно в различных клеточных сигнальных путях. Эти гРНК были разделены на четыре пары, и каждая пара нацелена на два геномных сайта в пределах локуса гена с расстоянием 350-750 п.н. между ними ( SI Приложение , рис.S1). Комбинируя разные пары гРНК, мы разработали гены PTG, , кодирующие две ( PTG3 / 4/5/6 ), четыре ( PTG7 / 8 ) и восемь ( PTG9 ) гРНК для одновременного воздействия на одну, две, и четыре локуса MPK соответственно (рис. 3 A и SI, приложение , таблица S1). Мы ожидали, что такая конструкция может привести к делеции короткого хромосомного фрагмента между двумя сайтами разреза Cas9 и позволит нам легко изучить эффективность PTG s.

Рис. 3.

Одновременное редактирование нескольких геномных сайтов в протопластах риса, экспрессирующих PTG: Cas9 . ( A ) Архитектура, компоненты гРНК и мишени PTG для редактирования мультиплексного генома. ( B ) ПЦР-детекция делеции хромосомного фрагмента в целевых локусах в протопластах риса, экспрессирующих соответствующие PTG с Cas9. Успешное удаление показано как усеченный продукт ПЦР (обозначен стрелками). Частота делеции хромосомного фрагмента (del%) указана внизу каждой дорожки.Образцы протопластов, экспрессирующие пустой вектор, использовали в качестве контроля (СК). ( C ) Репрезентативные последовательности делеции хромосомного фрагмента выровнены с таковой WT. Спаренная область гРНК помечена зеленым цветом, а область PAM показана красными буквами. Число в конце указывает удаленные (-) или вставленные (+) основания между двумя разрезами Cas9. Общая длина между двумя участками разреза Cas9 (помеченными ножницами) указана сверху. Короткие линии в выровненных последовательностях указывают на делеции.

Чтобы синтезировать PTG с повторяющейся архитектурой тРНК — гРНК, мы разработали масштабируемый и гибкий подход для сборки PTG s из компонентов ПЦР на основе принципа стратегии сборки Golden Gate (28) (см. SI Приложение , SI методы и подробности на рисунках S6 и S7). Наш подход к сборке генов позволил быстро синтезировать PTG s с различными комбинациями гРНК из обычных олигонуклеотидных праймеров. Используя одно- или двухэтапную сборку, мы синтезировали гены PTG3, — PTG9, и клонировали их в векторы, экспрессирующие CRISPR / Cas9 ( SI, приложение , рис.S2 и Таблицы S1 – S3).

Затем мы трансфицировали протопласты риса этими плазмидами, содержащими как U3p: PTG3-PTG9 , так и UBIp: Cas9 . Делеции хромосомных фрагментов в четырех локусах MAPK, которые были выявлены путем амплификации усеченных продуктов ПЦР с целевыми специфическими праймерами, были обнаружены в протопластах, экспрессирующих соответствующие PTG s с эффективностью 4–45% (рис. 3 B ). Несмотря на то, что восемь гРНК были одновременно произведены из PTG9 , они по-прежнему управляли Cas9 для эффективного вырезания хромосомных фрагментов во всех четырех целевых локусах с частотой 4–20% (рис.3 В ). Эффективность делеции фрагмента в локусах MPK5 и дополнительно подтверждали количественной ПЦР с использованием праймеров, охватывающих сайт разрезания gRNA2 ( SI, приложение , таблица S4). Секвенирование этих усеченных продуктов ПЦР подтвердило, что фрагменты между двумя сайтами разрезания gRNA / Cas9 были вырезаны из локусов-мишеней с дополнительными инделями или без них (фиг. 3 C ). В целом эффективность удаления фрагментов отрицательно коррелировала с расстоянием между двумя парными сайтами разрезания (коэффициент корреляции r = -0.95), несмотря на то, что разные гРНК могут иметь разную эффективность. Мы заметили, что общее количество gRNAs в одной PTG влияет на эффективность делеции с различной степенью на разных мишенях в протопластах (Fig. 3 B ). В трех локусах нацеливания ( MPK2 / 5/6 ) PTG ( PTG4 / 5/6 ), содержащие две гРНК, показали лишь немного более высокую эффективность, чем PTG с четырьмя ( PTG7 / 8 ) и восемью ( PTG9). ) гРНК. Однако в локусе MPK1 PTG3 (две гРНК) показали в ~ 2 раза более высокую частоту делеций, чем PTG7 (четыре гРНК) или PTG9 (восемь гРНК).Такое снижение эффективности PTG с большим количеством gRNA, вероятно, связано с конкуренцией за Cas9 среди gRNA. Тем не менее, PTG с тандемно выстроенной архитектурой тРНК-гРНК способен одновременно продуцировать многочисленные гРНК и с высокой эффективностью направлять Cas9 к множеству хромосомных мишеней.

Улучшение редактирования мультиплексного генома в стабильных трансгенных растениях с помощью PTG / Cas9.

Поскольку многие растения, включая важные сельскохозяйственные культуры, такие как рис, нельзя было легко регенерировать из протопластов, мы использовали обычную трансформацию, опосредованную Agrobacterium , для получения стабильных трансгенных линий и оценили эффективность системы PTG / Cas9 для мультиплексного редактирования генома в интактных рисовые растения.Частоту мутагенеза в мишенях gRNA1 и gRNA2 в трансгенных растениях, экспрессирующих sgRNA1: Cas9, sgRNA2: Cas9, PTG6: Cas9 или PTG7: Cas9, исследовали при поколении T ₀ . Среди T ₀ поколение sgRNA1: Cas9 ( n = 32) и sgRNA2: Cas9 ( n = 20), 44% и 60% из них несли инделы, тогда как 13% и 20% из них имели двуаллельные мутации. , соответственно (Таблица 1 и SI Приложение , Рис. S8). В отличие от этого, индели для обеих мишеней были обнаружены во всех растениях PTG6: Cas9 (100%, n = 17), включая 35% (gRNA1) и 76% (gRNA2) двуаллельных мутаций (таблица 1 и приложение SI , рис.S9). Однако делеция хромосомного фрагмента между сайтами-мишенями gRNA1 и gRNA2 не была обнаружена в растениях PTG6: Cas9 с помощью ПЦР, что может происходить с меньшей частотой в регенерированных каллусах / растениях, чем в протопластах. Тем не менее, результаты показали, что PTG6 не только экспрессировал две гРНК одновременно, но и достиг более высокой эффективности мутагенеза на отдельных мишенях, чем sgRNA (тест Стьюдента t , P <0,01) (таблица 1 и приложение SI , рис. . S8 и S9).

Таблица 1.

Эффективность целевых мутаций в PTG: Cas9 по сравнению с sgRNA: Cas9

Когда общее количество мишеней увеличилось до четырех в PTG7: Cas9, на участке gRNA1 наблюдалась частота инделения, сопоставимая с sgRNA1: Cas9. , но значительно более высокая частота инделей, чем sgRNA2: Cas9 была обнаружена в сайте gRNA2 (Таблица 1 и SI Приложение , Рис. S10). Интересно, что мы получили одну линию PTG7: Cas9 (6%), несущую двуаллельную делецию ∼350 п.н. в MPK1 и моноаллельную делецию ∼750 п.н. в MPK5 (рис.4 A и B ). Этот результат побудил нас продолжить изучение эффективности всех восьми гРНК в линиях PTG9: Cas9. На пяти мишенях гРНК (gRNA1 / 2/3/5/7), мутация которых разрушает сайты RE, 50% ( n = 14) линий PTG9: Cas9 T ₀ несут двуаллельные мутации на всех пяти мишенях ( SI Приложение , рис. S11). Интересно, что анализы ПЦР / RE показали, что эти пять гРНК демонстрируют сравнимую эффективность и что все они проявляют значительно более высокую активность мутагенеза, чем то, что мы наблюдали в линиях sgRNA1 / 2: Cas9 (Таблица 1).Секвенирование по Сэнгеру фрагментов из четырех локусов MPK и растений PTG9: Cas9 подтвердило, что мутации были внесены во все восемь сайтов ( SI, приложение , фиг. S12). Однако делеция фрагмента была обнаружена только в локусах MPK2 и MPK5 в двух линиях PTG9: Cas9 ( SI, приложение , рис. S11). По сравнению с протопластами, эффективность целевой делеции хромосомного фрагмента между парными сайтами разрезания gRNA / Cas9 ниже у трансгенных растений, что может быть связано с относительно более низкой экспрессией gRNA и Cas9 в каллусах риса / регенерированных растениях (обычно только одна копия трансгена интегрируется в геном риса после трансформации, опосредованной Agrobacterium ).Наши данные демонстрируют, что метод PTG не только увеличивает количество гРНК и сайтов нацеливания, но также, вероятно, повышает эффективность мутагенеза в отдельных сайтах, особенно когда несколько гРНК экспрессируются с использованием PTG.

Рис. 4.

Высокоэффективный направленный мутагенез в трансгенном рисе, экспрессирующем PTG: Cas9 . ( A и B ) Делеция хромосомного фрагмента в PTG7: растение Cas9 в поколении T ₀ . Примечательно, что только mpk1 с делецией 358 п.н. (Δ358) было обнаружено в геномной ДНК.Анализ последовательности продуктов ПЦР (число в скобках) показывает идентичный паттерн делеции в трансгенном растении. ( C ) Проростки альбиносов регенерировали из каллусов, трансформированных с помощью PTG10: Cas9 . Большинство проростков T ₀ (87%, n = 15) демонстрировали аналогичный фенотип фотообесцвечивания, что свидетельствует об очень высокой эффективности уничтожения PDS с помощью PTG10: Cas9 . Vec, контрольные растения трансформировали пустым вектором. (Шкала шкалы: 5 см.)

Чтобы дополнительно подтвердить высокую эффективность мутагенеза с PTG / Cas9, мы синтезировали PTG10 с двумя гРНК (gRNA9 и gRNA10) для нацеливания на ген фитоэн-десатуразы риса ( PDS ) ( SI Приложение , рис. S13). А ). PDS часто используется в качестве удобной генной мишени для изучения эффективности нокаута, поскольку растения с нулевой функциональной PDS могут приводить к видимому фотообесцвеченному фенотипу. Поразительно, что все трансгенные проростки PTG10: Cas9 (поколение T ₀ , n = 15), регенерированные из каллусов, показали фенотип фотообесцвечивания, и 13 из них были полностью альбиносами, что указывает на то, что эти растения несли нуль-функциональный PDS (рис. .4 С ). Хотя мы идентифицировали только одну линию, несущую хромосомные делеции между двумя сайтами-мишенями gRNA, секвенирование мишеней PDS из всех линий подтвердило, что индели были введены в сайты-мишени ( SI, приложение , рис. S13). Сравнивая эти данные с ранее сообщенной эффективностью системы sgRNA / Cas9 (9, 11, 29–32), насколько нам известно, подход PTG / Cas9 дал наивысшую эффективность целевого мутагенеза (до 100%) ( Инжир.4 и таблица 1) у растений. Наши результаты также демонстрируют, что нацеливание одного гена на две гРНК с использованием PTG значительно повысит эффективность полного нокаута гена.

Обсуждение

Мы разработали общую стратегию и платформу для получения нескольких gRNAs из одного синтетического гена PTG путем захвата системы обработки эндогенной тРНК (рис. 1). Мы также предоставили основу для разработки, синтеза и использования PTG для мультиплексного редактирования генома с помощью Cas9.Эти PTGs экспрессировались с промоторами Pol III (например, U3p ) таким же образом, как гены sgRNA , но не были обязаны начинаться с определенного нуклеотида (рис. 2). В результате современные векторы CRISPR / Cas9 для экспрессии sgRNA могут быть напрямую использованы для экспрессии PTG для редактирования мультиплексного генома, как мы продемонстрировали в этом исследовании.

Создавая несколько гРНК из одного полицистронного гена, технология PTG может быть использована для улучшения одновременного мутагенеза нескольких геномных локусов или делеции коротких хромосомных фрагментов (рис.3 и 4). Такой подход к геномной инженерии может привести к одновременному отключению нескольких генов, кодирующих белок, или удалению некодирующих участков РНК и других генетических элементов. В дополнение к целевому мутагенезу / делеции подход PTG может облегчить другие приложения на основе Cas9, в которых требуются множественные gRNAs. Например, PTG можно использовать с никазой Cas9 для повышения точности нацеливания (13, 33, 34) или с деактивированным активатором транскрипции Cas9 или -репрессором для управления экспрессией нескольких генов (35, 36).Учитывая высокую точность обработки и возможности РНКазы P и РНКазы Z, которые мы наблюдали (рис.2), система обработки тРНК также может быть использована в качестве общей платформы для производства других регуляторных РНК (например, короткой шпилечной РНК или искусственной микроРНК). от одного синтетического гена. Эти различные классы регуляторных РНК, такие как гРНК и короткая шпилечная РНК, также могут быть уплотнены в один полицистронный ген для разработки более сложных устройств для генной инженерии.

Недавно полицистронные транскрипты, которые слили гРНК с 28-нуклеотидной РНК (называемой гРНК-28nt), были успешно использованы для того, чтобы направлять Cas9 на мишень до четырех мишеней в клетках человека (12, 13).Синтетический ген с архитектурой gRNA-28nt продуцировал зрелые gRNA с 28-нуклеотидной дополнительной 3′-последовательностью, а также требовал коэкспрессии эндонуклеазы Csy4 из Pseudomonas aeruginosa для расщепления транскрипта. По сравнению со стратегией gRNA-28nt, наш подход использует надежную систему обработки эндогенной тРНК, которая обеспечивает точное производство gRNA только с дополнительной последовательностью от 1 до 4 нуклеотидов на 3′-конце gRNA (рис. 1 и 2) и не несет дополнительного риска токсичности эндонуклеазы Csy4 для реципиентов.Учитывая чрезвычайно большое количество генов тРНК с вариабельными последовательностями и тот факт, что РНКаза P и РНКаза Z точно распознают РНК-субстраты с тРНК-подобными структурами (18, 37), существует множество вариантов последовательностей тРНК для встраивания в PTG . Более того, система процессинга тРНК универсальна для всех живых организмов; таким образом, технология PTG может быть напрямую адаптирована к другим организмам для Cas9-опосредованной геномной инженерии.

Когда множественные двухцепочечные разрывы (DSB) в геномной ДНК были созданы с помощью PTG / Cas9 в растениях риса, индели, возникающие в результате подверженного ошибкам репарации NHEJ, возникали чаще, чем делеции фрагментов, возникающие при прямом соединении двух DSB ( SI Приложение , Рис.S10 и S11). На сегодняшний день молекулярный механизм, с помощью которого два DSBs напрямую соединяются вместе, чтобы генерировать хромосомную транслокацию или делецию фрагмента in vivo, в значительной степени неясен. Мы предполагаем, что процесс, приводящий к такому хромосомному расстройству, может потребовать двух DSB в один и тот же интервал времени и, вероятно, определяется высокодинамичным взаимодействием между разрезанием gRNA / Cas9 и эндогенной репарацией ДНК, а также расстоянием между DSB. Из-за различий в доставке, экспрессии и активности гРНК и Cas9 неудивительно видеть некоторые расхождения в частоте делеции фрагментов между протопластами (рис.3 B ) и стабильных трансгенных растений, а также среди различных трансгенных линий PTG (Рис. 4 A и SI Приложение , Рис. S9 – S11). Поскольку технология PTG позволяет генерировать множество DSB в геномной ДНК, она может предоставить эффективный инструмент, помогающий проанализировать молекулярный процесс хромосомной делеции. Что еще более важно, технология PTG значительно улучшает возможности и эффективность мультиплексного редактирования и, как ожидается, будет способствовать более сложным приложениям Cas9, таким как целевой мутагенез и удаление избыточных генов или генетических элементов, транскрипционная модуляция множества генов и путей, модификация и маркировка множества геномных сайты, сайт-специфическая интеграция и замена генов.

Материалы и методы

Растительные материалы.

Рис ( Oryza sativa L. ssp) сорта Китааке и Ниппонбаре использовался в данном исследовании. Растения риса выращивали в теплице или камере для выращивания при 28 ° C днем ​​/ 23 ° C ночью и 12 часах света.

Конструкция плазмидного вектора.

Плазмидный вектор pRGE32 был использован для временной экспрессии U3p: sgRNA или U3p: PTG вместе с UBIp: Cas9 в протопластах риса, а pRGEB32 был использован для трансформации риса, опосредованной Agrobacterium (приложение к стандарту SI Приложение , рис.S2). См. Приложение SI , SI Methods для получения подробной информации о конструировании плазмидного вектора.

экспрессионные конструкции sgRNA: Cas9 и PTG: Cas9.

Конструкции U3p: sgRNA1 и U3p: sgRNA2 получали, как описано ранее (24). Конкретные спейсерные последовательности для gRNA3-gRNA8 ( SI, приложение , таблица S3) были выбраны с использованием базы данных CRISPR-PLANT (www.genome.arizona.edu/crispr/) (38). Гены PTG, и конструкции U3p: PTG были созданы, как описано в приложении SI , SI методы , фиг.S6 и S7 и таблица S3. Синтезированные PTG вставляли в pRGE32 или pRGEB32, расщепленные BsaI, для временной экспрессии протопластов или стабильной трансформации риса, соответственно. Последовательности генов sgRNA1 , sgRNA2 и PTG , использованные в этом исследовании, перечислены в приложении SI, приложение , таблица S1.

Трансфекция протопластов риса.

Приготовление протопластов риса и трансфекцию выполняли, как описано ранее (24). Вкратце, 20 мкг плазмидной ДНК использовали для трансфекции 2 × 10 ⁵ протопластов с эффективностью трансфекции ~ 40-50%.Тотальную геномную ДНК риса экстрагировали из образцов протопластов через 36 часов после трансфекции, а затем использовали для ПЦР и анализа последовательностей.

Agrobacterium — опосредованная трансформация риса.

Трансгенные растения риса были получены посредством трансформации, опосредованной Agrobacterium tumefaciens , с использованием каллусов, полученных из зрелых семян риса, в соответствии с общепринятым протоколом (39).

Экстракция геномной ДНК и анализ ПЦР / RE.

Геномную ДНК риса экстрагировали, как описано ранее, методом гексадецилтриметиламмония бромида (24).Для обнаружения мутагенеза в желаемых сайтах целевые области амплифицировали со специфическими праймерами (см. SI Приложение , Таблица S2 для последовательностей праймеров) с использованием ДНК-полимеразы GoTaq (Promega). Продукт ПЦР разделяли в 1% агарозном геле и окрашивали бромидом этидия для обнаружения делеции хромосомного фрагмента. Для обнаружения инделей в конкретных сайтах с помощью ПЦР / RE продукты ПЦР, охватывающие целевые сайты, расщепляли соответствующими рестрикционными ферментами (RE) в течение 5 часов, а затем анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле и окрашивания бромидом этидия.Окрашенные гели визуализировали с помощью системы Gel Doc XRS (Bio-Rad) и количественно оценивали с помощью программы Quantity One 4.6 (Bio-Rad). Выбранные продукты ПЦР клонировали в вектор pGEM-T Easy (Promega) для секвенирования ДНК.

Регистрационный номер гена в GenBank.

Гены и их номера доступа RefSeq в GenBank следующие: MPK1 , Os06g0154500; МПК2 , Os08g0157000; МПК5 , Os03g0285800; МПК6 , Os10g0533600; UBI , Os02g0161900; и PDS , Os03g0184000.

Благодарности

Эта работа была поддержана Государственным университетом Пенсильвании и Программой исследования генома растений Национального научного фонда.

Сноски

• Автор: K.X. и Ю.Ю. спланированное исследование; K.X. и Б. проведенное исследование; K.X., B.M. и Y.Y. проанализированные данные; и К. и Ю.Я. написал газету.